【摘要】：Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑是一類特異的抑制蛋白酶活性的分子。作為效應(yīng)分子,直接作用于病原微生物和植食性昆蟲。桑樹(Morus alba L)具有眾多優(yōu)良的性狀,是重要的經(jīng)濟(jì)林木。在自然界中,桑樹面臨著病原微生物、農(nóng)業(yè)害蟲等的威脅。家蠶(Bombyx mori)屬于鱗翅目昆蟲,寡食桑葉。家蠶與桑樹“吃”與“被吃”的關(guān)系是一個協(xié)同進(jìn)化的過程。植物Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑作為一種防御手段,主要在植食性昆蟲的消化道中起作用,因此鑒定桑樹Kunitz基因,研究家蠶咬食處理下表達(dá)模式及MnKPI-9蛋白在家蠶的消化道中是否具有活性,了解桑樹Kunitz蛋白是否參與防御家蠶的咬食,為解析桑樹及其寡食性昆蟲的相互作用提供線索。研究的內(nèi)容及結(jié)果如下:1.桑樹Kunitz基因的鑒定、克隆及生物信息學(xué)分析本研究利用生物信息學(xué)的方法,在川桑(Morus notabilis)基因組中共鑒定得到20個Kunitz基因,分別命名為MnKPI-1-20(Kunitz-type serine proteinase inhibitors,KPIs)。克隆得到上述20個Kunitz基因。除MnKPI-6和MnKPI-20之外,其它Kunitz基因在N端具有信號肽,且20個Kunitz基因均具有保守的Kunitz結(jié)構(gòu)域,克隆得到的20個Kunitz基因同源性較高�；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明16個桑樹Kunitz基因無內(nèi)含子。通過NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,發(fā)現(xiàn)聚為一類的桑樹Kunitz基因位于同一個scaffold上,呈現(xiàn)基因串聯(lián)排布的現(xiàn)象。將包括桑樹在內(nèi)的132個Kunitz基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明,桑樹分布于C類群的I3B家族的Kunitz基因與野草莓、蘋果和桃的Kunitz基因具有較高的序列同源性,且與蒺藜苜蓿和大豆的親緣關(guān)系比較近。通過分析桑樹Kunitz基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)主要包括光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件和脅迫響應(yīng)元件三類。2.桑樹Kunitz基因表達(dá)分析利用qRT-PCR技術(shù)檢測桑樹Kunitz基因在川桑根、莖、葉、雌花和雄花5個組織的表達(dá)水平。結(jié)果表明,6個Kunitz基因在花中表達(dá)量相對較高,而MnKPI-6、MnKPI-7主要在根中表達(dá)。利用qRT-PCR技術(shù)檢測家蠶咬食處理下桑樹Kunitz基因在川桑葉片中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明,桑樹9個Kunitz基因在家蠶咬食處理后表達(dá)量不同程度地上調(diào),響應(yīng)家蠶咬食的誘導(dǎo)。3.MnKPI-9蛋白水平的表達(dá)分析及在家蠶消化道中的穩(wěn)定性分析通過Western Blot技術(shù)檢測MnKPI-9蛋白的組織表達(dá)水平及家蠶咬食處理后的表達(dá)水平。結(jié)果表明,正常狀態(tài)下MnKPI-9蛋白主要在川桑的雄花中表達(dá);響應(yīng)家蠶咬食的誘導(dǎo)。與轉(zhuǎn)錄本水平的表達(dá)相比,蛋白水平組織表達(dá)模式基本一致,蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)的時間有所延遲。通過比較MnKPI-9蛋白在川桑葉片、喂食川桑葉片的家蠶中腸內(nèi)容物和糞便中的含量分析發(fā)現(xiàn),MnKPI-9蛋白在家蠶的消化道中完整而穩(wěn)定地存在。結(jié)合Native-PAGE技術(shù)進(jìn)一步證明MnKPI-9蛋白在家蠶消化道中具有活性。對后續(xù)研究MnKPI-9蛋白防御昆蟲咬食桑樹的功能提供一個重要的線索。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S888.2
【圖文】：

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文除了直接防御外，植物還可以利用其它機(jī)制來保護(hù)自己。植食性昆蟲有大量的天敵，如食肉動物和寄生蜂，植物通過加強(qiáng)這些天敵的效應(yīng)，將其作為保護(hù)自身的保鏢，這種防御方式被稱為間接防御。這種類型的防御包括提供避難所、食物和化學(xué)信號，例如，植物可以為螞蟻和具有掠奪性的螨蟲提供巢穴，在植物受到害蟲攻擊時保護(hù)其免受傷害；植物也提供肉食動物所需的食物如蜂蜜或者被害蟲咬食時釋放的揮發(fā)物，玉米（Zea mays）在斜紋夜蛾（Prodenia litura）咬食時，釋放莽草酸的揮發(fā)物從而吸引它的天敵絨繭蜂（Cotesiamarginiventris）來對付斜紋夜蛾[22]；番茄（Lycopersicon esculentum）在甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）咬食時，會吸引它的天敵寄生蜂（Hyposoter exiguae）來對付甜菜夜蛾，從而保護(hù)番茄免受甜菜夜蛾的咬食（圖 1.1）[23]。

當(dāng)昆蟲咬食植物的葉片后，咬食的葉片處會產(chǎn)生信號分子，其中植物會產(chǎn)生一種前體物質(zhì)經(jīng)過加工剪切形成成熟的由 18 個氨基酸組成的小肽分子，取名叫系統(tǒng)素[25]，最先在番茄中鑒定到的能夠誘導(dǎo)表達(dá)蛋白酶抑制劑，通過韌皮部將信號傳遞至非咬食的葉片，通過與膜上受體識別結(jié)合啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。此外植物產(chǎn)生具有揮發(fā)性的茉莉酸甲酯分子將信號傳遞至臨近的非咬食的植株葉片[26-28]，從而使局部防御轉(zhuǎn)為系統(tǒng)防御，誘導(dǎo)表達(dá)防御蛋白蛋白酶抑制劑，提高植物防御植食性昆蟲咬食的能力。研究表明，植物被昆蟲咬食之后，除了產(chǎn)生系統(tǒng)素，還可通過 ABA、物理信號和電信號在細(xì)胞內(nèi)啟動相同的的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[29]，這些信號通過膜信號受體將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)的脂肪酶，從而促進(jìn)膜脂質(zhì)釋放亞麻酸，然后，亞麻酸通過脂肪酸途徑合成茉莉酸[30, 31]，進(jìn)一步誘導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控蛋白酶抑制劑基因的表達(dá)。此外，茉莉酸還可以誘導(dǎo)植物葉片產(chǎn)生揮發(fā)物，一方面吸引昆蟲的天敵食肉動物，保護(hù)植物免受昆蟲的侵襲，另一方面將信號傳遞至臨近非咬食的葉片，啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。該信號通路會受到其它因素的調(diào)控，如乙烯在通路下游促進(jìn)茉莉酸誘導(dǎo)防御蛋白蛋白酶抑制劑基因的表達(dá)[5]，而植物生長素和水楊酸對下游茉莉酸功能具有負(fù)調(diào)控機(jī)制[32]，此外，昆蟲的口頭分泌物也會促進(jìn)形成茉莉酸（圖 1.2）[5]。

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1 袁春華,梁宋平;Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)與功能研究[J];生命科學(xué)研究;2003年02期

2 陳丹丹;何南海;張名昌;;日本囊對蝦Kunitz型蛋白酶抑制劑在畢赤酵母中的表達(dá)純化及活性分析[J];生物工程學(xué)報;2008年03期

3 王克晶,海妻矩彥,高uQ┤

本文編號：2733584