【摘要】：研究背景與目的在中國(guó)和許多國(guó)家,肺癌的死亡率是所有癌癥中最高的,每年全世界大約有138萬(wàn)人死于肺癌。在我國(guó),肺癌位居全國(guó)癌癥發(fā)病首位。肺癌在組織學(xué)上分為四類:肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、大細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌。肺腺癌是一種起源于腺體的上皮癌,是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中最常見(jiàn)的病理亞型,即使從未吸煙的人也會(huì)患肺腺癌。由于肺腺癌是一種高異質(zhì)性腫瘤,有多種分子、臨床和病理學(xué)特征,因此其致癌驅(qū)動(dòng)因子的發(fā)現(xiàn)提高了我們對(duì)肺腺癌生物學(xué)的理解。對(duì)肺腺癌分子變異的認(rèn)識(shí)促進(jìn)了針對(duì)這些變異的個(gè)體化療法,并引領(lǐng)了“個(gè)性化”腫瘤醫(yī)學(xué)的新時(shí)代。例如,帶有表皮生長(zhǎng)因子受體基因(EGFR)激活突變的肺腺癌患者使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)的效果比無(wú)EGFR基因突變患者的效果好,間變性淋巴瘤激酶(ALK)基因重排是TKI克里唑替尼對(duì)肺腺癌治療效果的最佳預(yù)測(cè)因子。這些事實(shí)表明,治療效果與特異性腫瘤基因組變異的存在有關(guān)。但是,有EGFR基因突變或ALK基因融合的患者只占肺腺癌患者的三分之一,說(shuō)明了理解無(wú)EGFR基因突變或ALK基因融合肺腺癌的遺傳基礎(chǔ)的必要性。肺腺癌發(fā)生的潛在分子機(jī)制尚不清楚,而肺癌的異質(zhì)性也讓我們很難理解這種疾病。有EGFR或ALK變異的肺腺癌患者是否具有不同于沒(méi)有這些變異的患者的獨(dú)特遺傳特征,還不得而知。而且,對(duì)肺癌,尤其是無(wú)EGFR基因突變或ALK基因融合肺腺癌中的重點(diǎn)基因的拷貝數(shù)和基因表達(dá)的相關(guān)性了解很少。另外,由于肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展是由基因與基因之間的相互作用及調(diào)控失調(diào)引起的,因此明確調(diào)控通路中的治療靶點(diǎn)有助于深刻理解肺腺癌的病因和發(fā)病機(jī)理。這些肺癌相關(guān)基因是否影響細(xì)胞功能,以及如何協(xié)調(diào)以影響細(xì)胞功能,尚未得到廣泛研究�；贓GFR突變或ALK融合癌基因的靶向治療已成為某些肺腺癌(LUAD)患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法,但是,大多數(shù)LUAD患者并沒(méi)有EGFR基因突變或ALK基因融合,而且其癌基因變異的特征仍有待明確。在本研究中,我們回顧性地分析了肺腺癌和肺鱗癌患者的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)。我們對(duì)23個(gè)首席候選基因的腫瘤基因組變異進(jìn)行評(píng)估,以探討這兩種肺癌類型之間的異同點(diǎn)。并進(jìn)一步評(píng)估了十例顯微切割的、無(wú)EGFR基因突變或ALK基因融合的肺腺癌中的這些候遠(yuǎn)基因的拷貝數(shù)。同時(shí)進(jìn)一步探索了一些基因的拷貝數(shù)和基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。本研究顯示,在無(wú)EGFR基因突變或ALK基因融合的肺腺癌中,PTEN在基因組DNA和mRNA水平上的變化一致。這些結(jié)果提供了一個(gè)驗(yàn)證肺癌變相關(guān)分子的方法,并為肺腺癌治療靶點(diǎn)的確定提供了依據(jù)。材料和方法標(biāo)本是從2009年1月至2012年6月在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院接受初次手術(shù)的十名肺腺癌患者身上采集的,包括來(lái)自同一名患者的腫瘤組織和遠(yuǎn)離腫瘤的正常組織。用手術(shù)切除的肺組織獲取原發(fā)肺腺癌和遠(yuǎn)離腫瘤的正常肺組織標(biāo)本,并保存為福爾馬林固定的石蠟切片,用于生物標(biāo)志物和病理分析。對(duì)從臨床分子診斷實(shí)驗(yàn)室獲取的肺癌標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變和ALK基因融合檢測(cè)。從福爾馬林固定的石蠟組織切片中提取基因組DNA和總RNA。采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)、用人EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒分析EGFR基因突變。采用多路一步法RT-PCR技術(shù)、用人ALK基因融合檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALK基因融合變異。在7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上完成RT-PCR,并通過(guò)對(duì)PCR和RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序確認(rèn)EGFR基因突變和ALK基因融合不存在。分析基因拷貝數(shù)和基因表達(dá),用ArcturusPixCell II系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)和奧林巴斯IX-50顯微鏡從靶組織切片中激光捕獲顯微切割細(xì)胞(5 × 103),用 PicoPure RNA 提取試劑盒(Thermo Fisher Scientific)提取RNA,并用RT-PCR法擴(kuò)增。用PicoPure DNA分離試劑盒(Thermo Fisher Scientific)從顯微切割組織中提取基因組DNA。用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)測(cè)量濃度。拷貝數(shù)的定量分析是用(QIAGEN qBiomarker拷貝數(shù)PCR檢測(cè)法在7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)上完成。每個(gè)標(biāo)本的相對(duì)基因拷貝數(shù)計(jì)算為:2 × T拷貝數(shù)(腫瘤拷貝數(shù)/MRef拷貝數(shù))/N拷貝數(shù)(同一患者的遠(yuǎn)離腫瘤的正常組織的拷貝數(shù)/MRef拷貝數(shù))�；虮磉_(dá)的定量 PCR(qPCR)用 Power SYBR Green Master Mixture(Thermo Fisher Scientific)由7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)來(lái)完成。逆轉(zhuǎn)錄用隨機(jī)六聚體引物和SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific)來(lái)完成。倍數(shù)變化是用△ △Ct法來(lái)計(jì)算。相對(duì)基因表達(dá)檢測(cè)的內(nèi)源參照基因?yàn)镚APDH。我們對(duì)公共數(shù)據(jù)集進(jìn)行綜合分析,以評(píng)估23個(gè)肺癌相關(guān)基因的基因組學(xué)變異。本研究使用的所有數(shù)據(jù)集均來(lái)自公開(kāi)的數(shù)據(jù)來(lái)源,包括Broad(哈佛-麻省理工學(xué)院Broad研究所)和MSKCC(紀(jì)念斯隆凱特林癌癥中心),或來(lái)自各種計(jì)劃,包括TCGA(癌癥基因組圖譜計(jì)劃-癌癥基因組)和TSP(腫瘤測(cè)序計(jì)劃)。肺腺癌和肺鱗癌患者腫瘤組織的全基因組外顯子組或靶向測(cè)序數(shù)據(jù)及人口統(tǒng)計(jì)信息提取自以前的研究(所有測(cè)序數(shù)據(jù)均已在線存儲(chǔ))。用c-Bioportal完成23個(gè)肺癌相關(guān)基因(用QIAGEN在人肺癌拷貝數(shù)PCR芯片中挑選出來(lái)的)的跨癌癥變異的整合。用cBioPortal癌癥基因組網(wǎng)站(網(wǎng)址http://www.cbioportal.org)完成數(shù)據(jù)挖掘,以測(cè)定與這些基因的變異有關(guān)的情況的發(fā)生率。腫瘤組織和遠(yuǎn)離腫瘤的正常對(duì)照組織之間的基因拷貝數(shù)差異用非參數(shù)曼-惠特尼U檢驗(yàn)來(lái)分析。腫瘤組織和遠(yuǎn)離腫瘤的正常對(duì)照組織之間的基因表達(dá)差異用配對(duì)雙樣本t檢驗(yàn)來(lái)分析。DNA拷貝數(shù)和基因表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)用皮爾遜相關(guān)性檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估。用標(biāo)準(zhǔn)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)和Bonferroni校正法分析腫瘤基因組變異。P0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。用SPSS 24,R軟件包和GraphPad Prism 6.0完成分析。結(jié)果1.肺癌相關(guān)基因的體細(xì)胞變異分析CCND1、CSMD1、EGFR、EMSY、MYC、PDGFRA、PIK3CA、PTPRD、RB1、REL和ZNF217,表現(xiàn)出多種變異(同時(shí)發(fā)生擴(kuò)增、缺失和突變)。在肺鱗癌中只有MYC基因有多種變異,而在肺腺癌中CCND1、EMSY、PIK3CA和ZNF217基因均有多種變異。肺腺癌中CCND1、PIK3CA、FGFR1、REL和ZNF217基因擴(kuò)增的頻率高于肺鱗癌,肺鱗癌的EMSY、PDGFRA和REL基因突變頻率高于肺腺癌。2.無(wú)EGFR基因突變或ALK基因融合肺腺癌患者的臨床病理學(xué)特征這些患者包括5名男性和5名女性,平均年齡55歲(范圍:46～72歲)。其中6名患者從未吸過(guò)煙,4名患者吸煙。這些患者的腫瘤均為EGFR基因突變和ALK基因融合陰性。病理分期為“腫瘤Ⅱ期”(n=7)和“腫瘤Ⅲ期”(n=3),以“中等分化”級(jí)別為主(n=5)。6名患者的腫瘤侵犯局部淋巴結(jié)。3.肺腺癌患者的腫瘤和對(duì)應(yīng)正常肺組織的基因拷貝數(shù)的對(duì)比定量與正常肺組織相比,23種基因中大多數(shù)的拷貝數(shù)變異沒(méi)有顯著變化。三種抑癌基因(PTEN、RB1和PTPRD)和一種致癌基因(HMGA2)在肺腺癌組織中的拷貝數(shù)較低(P0.05)。4.肺腺癌患者腫瘤組織中低拷貝數(shù)基因的拷貝數(shù)與mRNA水平之間的關(guān)聯(lián)腫瘤組織與正常組織中的mRNA水平比較結(jié)果顯示,抑癌基因PTEN和RB1的表達(dá)水平明顯較低(P0.05)。抑癌基因PTPRD和致癌基因HMGA2,肺腺癌腫瘤組織與正常組織中的基因表達(dá)沒(méi)有顯著差異(PTPRD:n=6,P=0.506;HMGA2:n=8,P=0.462)。雖然腫瘤組織中的 PTEN 和 RB1mRNA水平都有所降低,但只有PTEN基因的拷貝數(shù)與表達(dá)相關(guān)(R2=0.827,P=0.003)。5.無(wú)EGFR基因突變或ALK基因融合肺腺癌中基于拷貝數(shù)的肺癌相關(guān)基因相互關(guān)系EMSY 與 CCND1、EMSY 與 PIK3CA、CCND1 與 CDKN2A 以及 CCND1與PIK3CA之間的相關(guān)性較強(qiáng)(均為P0.001)。EMSY與CCND1、EMSY與PIK3CA以及CCND1與PIK3CA之間呈正相關(guān)(矩陣值均0.9)。CDKN2A基因起腫瘤抑制作用,與CCND1呈負(fù)相關(guān)(矩陣值=-0.927,P0.001)。結(jié)論我們對(duì)公共數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析,以評(píng)估23種肺癌相關(guān)基因的基因組變異,并查找肺腺癌和肺鱗癌的病因和發(fā)病機(jī)理。我們還評(píng)估了無(wú)EGFR基因突變或ALK基因融合肺腺癌患者的手術(shù)切除腫瘤和遠(yuǎn)離腫瘤的正常肺組織的腫瘤基因組學(xué)特征,并評(píng)估了這些候選基因之間可能存在的關(guān)系。我們的研究結(jié)果對(duì)無(wú)EGFR基因突變或ALK基因融合肺腺癌的分子分層和治療靶點(diǎn)有重要意義。這些信息也推動(dòng)了我們對(duì)與腫瘤基因組拷貝數(shù)變異和基因表達(dá)有關(guān)的肺癌發(fā)生的理解,有助于確定肺腺癌患者的個(gè)性化治療策略。在為無(wú)EGFR基因突變或ALK基因融合的肺腺癌患者制定治療策略時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮PTEN-PIK3CA 和 RB1-CCND1 通路。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R734.2
【圖文】：

其次，患者來(lái)自單一機(jī)構(gòu)，因此會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)診偏倚。另外，ＤＮＡ拷貝逡逑數(shù)和ｍＲＮＡ水平的定量方法無(wú)法區(qū)分基因突變，因?yàn)槟承┗颍ㄈ纾遥拢保┑腻义贤蛔儯⒎侨笔В▓D１），而是顯性失活突變，并且參與了癌發(fā)生�？紤]到逡逑腫瘤異質(zhì)性造成的固有偏倚和我們無(wú)法解釋的變量的存在，樣本量小可能會(huì)逡逑導(dǎo)致２３種基因的基因組學(xué)特征之間的關(guān)聯(lián)被忽略。不過(guò)，盡管缺少腫瘤大逡逑小、位置等臨床信息，這仍是首個(gè)定量無(wú)ＥＧＦＲ基因突變或ＡＬＫ基因融合逡逑肺腺癌患者的腫瘤基因組異常的研宄。此外，吸煙和性別是肺癌的危險(xiǎn)因素，逡逑吸煙增加了非小細(xì)胞肺癌的拷貝數(shù)改變［８３，８４］，表明這些因素也可能影響上述逡逑這些基因拷貝數(shù)。逡逑３６逡逑

圖２：無(wú)ＥＧＦＲ基因突變或ＡＬＫ基因融合的肺腺癌中的匥因拷貝數(shù)對(duì)比分析定量十名無(wú)ＥＧＦＲ基逡逑因突變或ＡＬＫ基因融合肺腺癌患者的顯微切割腫瘤細(xì)胞與對(duì)應(yīng)的遠(yuǎn)離腫瘤的正常肺上皮細(xì)胞中的逡逑２３種肺癌相關(guān)候選基因的拷貝數(shù)。ｙ軸指拷貝數(shù)指數(shù)，用２邋ｘＴ拷貝數(shù)／Ｎ拷貝數(shù)計(jì)算，其中，Ｔ逡逑代表腫瘤細(xì)胞，Ｎ代表遠(yuǎn)離腫瘤的正常肺上皮細(xì)胞。每個(gè)圓圈表示一名患者的特定基因的一個(gè)拷貝逡逑數(shù)指數(shù)。＊Ｐ＜邋０．０５，腫瘤細(xì)胞與對(duì)應(yīng)的遠(yuǎn)離腫瘤的正常肺上皮細(xì)胞之間的對(duì)比，用曼惠特尼Ｕ檢逡逑驗(yàn)來(lái)分析。逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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1 董強(qiáng)剛;韓寶惠;黃進(jìn)肅;楊立民;黃建;趙春英;盧麗琴;;176例非小細(xì)胞肺癌的EGFR基因突變分析[J];中華腫瘤雜志;2006年09期

本文編號(hào)：2733458