發(fā)布時間：2020-06-28 21:06

【摘要】：研究背景與目的在中國和許多國家,肺癌的死亡率是所有癌癥中最高的,每年全世界大約有138萬人死于肺癌。在我國,肺癌位居全國癌癥發(fā)病首位。肺癌在組織學(xué)上分為四類:肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、大細胞肺癌和小細胞肺癌。肺腺癌是一種起源于腺體的上皮癌,是非小細胞肺癌(NSCLC)中最常見的病理亞型,即使從未吸煙的人也會患肺腺癌。由于肺腺癌是一種高異質(zhì)性腫瘤,有多種分子、臨床和病理學(xué)特征,因此其致癌驅(qū)動因子的發(fā)現(xiàn)提高了我們對肺腺癌生物學(xué)的理解。對肺腺癌分子變異的認識促進了針對這些變異的個體化療法,并引領(lǐng)了“個性化”腫瘤醫(yī)學(xué)的新時代。例如,帶有表皮生長因子受體基因(EGFR)激活突變的肺腺癌患者使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)的效果比無EGFR基因突變患者的效果好,間變性淋巴瘤激酶(ALK)基因重排是TKI克里唑替尼對肺腺癌治療效果的最佳預(yù)測因子。這些事實表明,治療效果與特異性腫瘤基因組變異的存在有關(guān)。但是,有EGFR基因突變或ALK基因融合的患者只占肺腺癌患者的三分之一,說明了理解無EGFR基因突變或ALK基因融合肺腺癌的遺傳基礎(chǔ)的必要性。肺腺癌發(fā)生的潛在分子機制尚不清楚,而肺癌的異質(zhì)性也讓我們很難理解這種疾病。有EGFR或ALK變異的肺腺癌患者是否具有不同于沒有這些變異的患者的獨特遺傳特征,還不得而知。而且,對肺癌,尤其是無EGFR基因突變或ALK基因融合肺腺癌中的重點基因的拷貝數(shù)和基因表達的相關(guān)性了解很少。另外,由于肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展是由基因與基因之間的相互作用及調(diào)控失調(diào)引起的,因此明確調(diào)控通路中的治療靶點有助于深刻理解肺腺癌的病因和發(fā)病機理。這些肺癌相關(guān)基因是否影響細胞功能,以及如何協(xié)調(diào)以影響細胞功能,尚未得到廣泛研究�；贓GFR突變或ALK融合癌基因的靶向治療已成為某些肺腺癌(LUAD)患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法,但是,大多數(shù)LUAD患者并沒有EGFR基因突變或ALK基因融合,而且其癌基因變異的特征仍有待明確。在本研究中,我們回顧性地分析了肺腺癌和肺鱗癌患者的基因組測序數(shù)據(jù)。我們對23個首席候選基因的腫瘤基因組變異進行評估,以探討這兩種肺癌類型之間的異同點。并進一步評估了十例顯微切割的、無EGFR基因突變或ALK基因融合的肺腺癌中的這些候遠基因的拷貝數(shù)。同時進一步探索了一些基因的拷貝數(shù)和基因表達之間的關(guān)聯(lián)。本研究顯示,在無EGFR基因突變或ALK基因融合的肺腺癌中,PTEN在基因組DNA和mRNA水平上的變化一致。這些結(jié)果提供了一個驗證肺癌變相關(guān)分子的方法,并為肺腺癌治療靶點的確定提供了依據(jù)。材料和方法標(biāo)本是從2009年1月至2012年6月在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院接受初次手術(shù)的十名肺腺癌患者身上采集的,包括來自同一名患者的腫瘤組織和遠離腫瘤的正常組織。用手術(shù)切除的肺組織獲取原發(fā)肺腺癌和遠離腫瘤的正常肺組織標(biāo)本,并保存為福爾馬林固定的石蠟切片,用于生物標(biāo)志物和病理分析。對從臨床分子診斷實驗室獲取的肺癌標(biāo)本進行EGFR基因突變和ALK基因融合檢測。從福爾馬林固定的石蠟組織切片中提取基因組DNA和總RNA。采用實時熒光PCR技術(shù)、用人EGFR基因突變檢測試劑盒分析EGFR基因突變。采用多路一步法RT-PCR技術(shù)、用人ALK基因融合檢測試劑盒檢測ALK基因融合變異。在7500實時PCR系統(tǒng)上完成RT-PCR,并通過對PCR和RT-PCR產(chǎn)物進行直接測序確認EGFR基因突變和ALK基因融合不存在。分析基因拷貝數(shù)和基因表達,用ArcturusPixCell II系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)和奧林巴斯IX-50顯微鏡從靶組織切片中激光捕獲顯微切割細胞(5 × 103),用 PicoPure RNA 提取試劑盒(Thermo Fisher Scientific)提取RNA,并用RT-PCR法擴增。用PicoPure DNA分離試劑盒(Thermo Fisher Scientific)從顯微切割組織中提取基因組DNA。用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific)測量濃度�？截悢�(shù)的定量分析是用(QIAGEN qBiomarker拷貝數(shù)PCR檢測法在7500實時PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)上完成。每個標(biāo)本的相對基因拷貝數(shù)計算為:2 × T拷貝數(shù)(腫瘤拷貝數(shù)/MRef拷貝數(shù))/N拷貝數(shù)(同一患者的遠離腫瘤的正常組織的拷貝數(shù)/MRef拷貝數(shù))。基因表達的定量 PCR(qPCR)用 Power SYBR Green Master Mixture(Thermo Fisher Scientific)由7500實時PCR系統(tǒng)來完成。逆轉(zhuǎn)錄用隨機六聚體引物和SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific)來完成。倍數(shù)變化是用△ △Ct法來計算。相對基因表達檢測的內(nèi)源參照基因為GAPDH。我們對公共數(shù)據(jù)集進行綜合分析,以評估23個肺癌相關(guān)基因的基因組學(xué)變異。本研究使用的所有數(shù)據(jù)集均來自公開的數(shù)據(jù)來源,包括Broad(哈佛-麻省理工學(xué)院Broad研究所)和MSKCC(紀(jì)念斯隆凱特林癌癥中心),或來自各種計劃,包括TCGA(癌癥基因組圖譜計劃-癌癥基因組)和TSP(腫瘤測序計劃)。肺腺癌和肺鱗癌患者腫瘤組織的全基因組外顯子組或靶向測序數(shù)據(jù)及人口統(tǒng)計信息提取自以前的研究(所有測序數(shù)據(jù)均已在線存儲)。用c-Bioportal完成23個肺癌相關(guān)基因(用QIAGEN在人肺癌拷貝數(shù)PCR芯片中挑選出來的)的跨癌癥變異的整合。用cBioPortal癌癥基因組網(wǎng)站(網(wǎng)址http://www.cbioportal.org)完成數(shù)據(jù)挖掘,以測定與這些基因的變異有關(guān)的情況的發(fā)生率。腫瘤組織和遠離腫瘤的正常對照組織之間的基因拷貝數(shù)差異用非參數(shù)曼-惠特尼U檢驗來分析。腫瘤組織和遠離腫瘤的正常對照組織之間的基因表達差異用配對雙樣本t檢驗來分析。DNA拷貝數(shù)和基因表達水平之間的關(guān)聯(lián)用皮爾遜相關(guān)性檢驗來評估。用標(biāo)準(zhǔn)錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)和Bonferroni校正法分析腫瘤基因組變異。P0.05時有統(tǒng)計學(xué)顯著性,所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗。用SPSS 24,R軟件包和GraphPad Prism 6.0完成分析。結(jié)果1.肺癌相關(guān)基因的體細胞變異分析CCND1、CSMD1、EGFR、EMSY、MYC、PDGFRA、PIK3CA、PTPRD、RB1、REL和ZNF217,表現(xiàn)出多種變異(同時發(fā)生擴增、缺失和突變)。在肺鱗癌中只有MYC基因有多種變異,而在肺腺癌中CCND1、EMSY、PIK3CA和ZNF217基因均有多種變異。肺腺癌中CCND1、PIK3CA、FGFR1、REL和ZNF217基因擴增的頻率高于肺鱗癌,肺鱗癌的EMSY、PDGFRA和REL基因突變頻率高于肺腺癌。2.無EGFR基因突變或ALK基因融合肺腺癌患者的臨床病理學(xué)特征這些患者包括5名男性和5名女性,平均年齡55歲(范圍:46～72歲)。其中6名患者從未吸過煙,4名患者吸煙。這些患者的腫瘤均為EGFR基因突變和ALK基因融合陰性。病理分期為“腫瘤Ⅱ期”(n=7)和“腫瘤Ⅲ期”(n=3),以“中等分化”級別為主(n=5)。6名患者的腫瘤侵犯局部淋巴結(jié)。3.肺腺癌患者的腫瘤和對應(yīng)正常肺組織的基因拷貝數(shù)的對比定量與正常肺組織相比,23種基因中大多數(shù)的拷貝數(shù)變異沒有顯著變化。三種抑癌基因(PTEN、RB1和PTPRD)和一種致癌基因(HMGA2)在肺腺癌組織中的拷貝數(shù)較低(P0.05)。4.肺腺癌患者腫瘤組織中低拷貝數(shù)基因的拷貝數(shù)與mRNA水平之間的關(guān)聯(lián)腫瘤組織與正常組織中的mRNA水平比較結(jié)果顯示,抑癌基因PTEN和RB1的表達水平明顯較低(P0.05)。抑癌基因PTPRD和致癌基因HMGA2,肺腺癌腫瘤組織與正常組織中的基因表達沒有顯著差異(PTPRD:n=6,P=0.506;HMGA2:n=8,P=0.462)。雖然腫瘤組織中的 PTEN 和 RB1mRNA水平都有所降低,但只有PTEN基因的拷貝數(shù)與表達相關(guān)(R2=0.827,P=0.003)。5.無EGFR基因突變或ALK基因融合肺腺癌中基于拷貝數(shù)的肺癌相關(guān)基因相互關(guān)系EMSY 與 CCND1、EMSY 與 PIK3CA、CCND1 與 CDKN2A 以及 CCND1與PIK3CA之間的相關(guān)性較強(均為P0.001)。EMSY與CCND1、EMSY與PIK3CA以及CCND1與PIK3CA之間呈正相關(guān)(矩陣值均0.9)。CDKN2A基因起腫瘤抑制作用,與CCND1呈負相關(guān)(矩陣值=-0.927,P0.001)。結(jié)論我們對公共數(shù)據(jù)集進行分析,以評估23種肺癌相關(guān)基因的基因組變異,并查找肺腺癌和肺鱗癌的病因和發(fā)病機理。我們還評估了無EGFR基因突變或ALK基因融合肺腺癌患者的手術(shù)切除腫瘤和遠離腫瘤的正常肺組織的腫瘤基因組學(xué)特征,并評估了這些候選基因之間可能存在的關(guān)系。我們的研究結(jié)果對無EGFR基因突變或ALK基因融合肺腺癌的分子分層和治療靶點有重要意義。這些信息也推動了我們對與腫瘤基因組拷貝數(shù)變異和基因表達有關(guān)的肺癌發(fā)生的理解,有助于確定肺腺癌患者的個性化治療策略。在為無EGFR基因突變或ALK基因融合的肺腺癌患者制定治療策略時應(yīng)優(yōu)先考慮PTEN-PIK3CA 和 RB1-CCND1 通路。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
【圖文】：

其次，患者來自單一機構(gòu)，因此會產(chǎn)生轉(zhuǎn)診偏倚。另外，ＤＮＡ拷貝逡逑數(shù)和ｍＲＮＡ水平的定量方法無法區(qū)分基因突變，因為某些基因（如ＲＢ１）的逡逑突變，并非缺失（圖１），而是顯性失活突變，并且參與了癌發(fā)生�？紤]到逡逑腫瘤異質(zhì)性造成的固有偏倚和我們無法解釋的變量的存在，樣本量小可能會逡逑導(dǎo)致２３種基因的基因組學(xué)特征之間的關(guān)聯(lián)被忽略。不過，盡管缺少腫瘤大逡逑小、位置等臨床信息，這仍是首個定量無ＥＧＦＲ基因突變或ＡＬＫ基因融合逡逑肺腺癌患者的腫瘤基因組異常的研宄。此外，吸煙和性別是肺癌的危險因素，逡逑吸煙增加了非小細胞肺癌的拷貝數(shù)改變［８３，８４］，表明這些因素也可能影響上述逡逑這些基因拷貝數(shù)。逡逑３６逡逑

圖２：無ＥＧＦＲ基因突變或ＡＬＫ基因融合的肺腺癌中的匥因拷貝數(shù)對比分析定量十名無ＥＧＦＲ基逡逑因突變或ＡＬＫ基因融合肺腺癌患者的顯微切割腫瘤細胞與對應(yīng)的遠離腫瘤的正常肺上皮細胞中的逡逑２３種肺癌相關(guān)候選基因的拷貝數(shù)。ｙ軸指拷貝數(shù)指數(shù)，用２邋ｘＴ拷貝數(shù)／Ｎ拷貝數(shù)計算，其中，Ｔ逡逑代表腫瘤細胞，Ｎ代表遠離腫瘤的正常肺上皮細胞。每個圓圈表示一名患者的特定基因的一個拷貝逡逑數(shù)指數(shù)。＊Ｐ＜邋０．０５，腫瘤細胞與對應(yīng)的遠離腫瘤的正常肺上皮細胞之間的對比，用曼惠特尼Ｕ檢逡逑驗來分析。逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 董強剛;韓寶惠;黃進肅;楊立民;黃建;趙春英;盧麗琴;;176例非小細胞肺癌的EGFR基因突變分析[J];中華腫瘤雜志;2006年09期

本文編號：2733458