【摘要】：丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)因具有廣泛的藥理作用而被中醫(yī)藥市場大量需求,其主要藥效成分為丹參酮和丹酚酸,這兩類物質(zhì)含量是丹參制劑的主要質(zhì)量指標(biāo),所以如何提高丹參中這兩類物質(zhì)的含量是丹參研究的重點。磷是植物生長必須的營養(yǎng)元素,然而土壤中的磷元素易被固化,目前很多丹參種植區(qū)域面臨可吸收磷資源貧乏的問題。低磷脅迫會引起植物代謝的改變,促進次生代謝物的積累,如果低磷可以促進丹參中藥效成分的積累,將會是一個既節(jié)省資源又環(huán)保增產(chǎn)的策略。本研究中,我們首先探討了不同程度的磷缺失對紫花丹參植株生長及代謝調(diào)控的影響,篩選出次生代謝積累的最適磷濃度,并以紫花丹參和絨毛鼠尾草毛狀根為材料,研究兩種鼠尾草屬植物對低磷響應(yīng)機制的異同。為了進一步研究次生代謝與低磷響應(yīng)之間的關(guān)聯(lián),我們從丹參中克隆出兩條響應(yīng)低磷脅迫的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子:SmMYB98b和SmMYB9a,對它們的功能進行研究,發(fā)現(xiàn)這兩個轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)控丹參酮的積累,且參與了丹參對低磷的響應(yīng)。此外我們還克隆得到兩個低磷響應(yīng)信號通路中的SPX基因:SmSPX2和SmSPX4,SmMYB9a與SmSPX2、SmSPX4都存在互作。具體研究結(jié)果如下:1.研究土壤中四個磷濃度:全磷(200 mg/kg)、輕度缺失(100 mg/kg)、重度缺失(10 mg/kg)及完全缺失(0 mg/kg)對紫花丹參植株生長發(fā)育及次生代謝指標(biāo)的影響。與全磷相比,磷輕度及重度缺失情況下丹參植株中磷含量明顯減少,根的生物量變化不明顯;光合作用增強,多糖和花青素積累增加;GA含量降低,IAA含量升高。隨著土壤中磷濃度的降低,丹參根中四種丹參酮的含量呈上升趨勢,磷完全缺失情況下,丹參根中丹參酮I、二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮IIA的含量分別為對照的7.31、4.5、7.55和1.97倍。2.以丹參(紫花丹參)和絨毛鼠尾草的毛狀根為材料,進一步研究兩種鼠尾草屬植物對低磷脅迫響應(yīng)機制的異同。結(jié)果顯示,低磷促進了這兩種鼠尾草毛狀根中丹參酮的積累及丹參酮合成通路關(guān)鍵酶基因的表達,增強了丹參提取物的抗氧化活性。與紫花丹參相比,絨毛鼠尾草中有效磷含量較高,且能夠更積極的對低磷脅迫做出響應(yīng),具體表現(xiàn)在次生代謝物的積累,合成通路酶基因的表達,抗氧化活性及SPX基因的表達。3.參照丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,通過基因克隆得到開放閱讀框為699 bp的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子SmMYB98b,SmMYB98b編碼232個氨基酸,預(yù)測的蛋白分子量為27 KD,等電點7.58。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)SmMYB98b屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的第20亞家族,與擬南芥中參與低磷信號的AtMYB2和AtMYB62聚為一類。SmMYB98b蛋白定位于細(xì)胞核,為核定位的轉(zhuǎn)錄因子。通過遺傳轉(zhuǎn)化成功獲得SmMYB98b過表達(OE-SmMYB98b)及沉默表達(RNAi-SmMYB98b)的轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根。OE-SmMYB98b毛狀根中磷濃度降低,磷響應(yīng)基因被誘導(dǎo)。與野生型毛狀根相比,OE-SmMYB98b毛狀根中丹參酮含量升高了6-30倍,丹參酮合成通路關(guān)鍵酶基因的表達也被顯著誘導(dǎo)。而RNAi-SmMYB98b毛狀根中丹參酮含量降低,丹參酮合成通路關(guān)鍵酶基因的表達被強烈抑制。SmMYB98b對丹參酮的調(diào)控受磷水平影響,低磷脅迫縮小了OE-SmMYB98b毛狀根與RNAi-SmMYB98b毛狀根中丹參酮積累的差距。4.參照丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,通過基因克隆得到開放閱讀框為786 bp的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子SmMYB9a。SmMYB9a編碼261個氨基酸,預(yù)測其分子量為29.8 KD,等電點為6.4。SmMYB9a在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布且主要分布在細(xì)胞核中,原核表達分析發(fā)現(xiàn)SmMYB9a編碼的蛋白大小與生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果一致。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)SmMYB9a同樣屬于S20亞家族,低磷脅迫抑制了SmMYB9a的表達。通過遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得了SmMYB9a的過表達(OE-SmMYB9a)及沉默表達(RNAi-SmMYB9a)轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根,與野生型相比,OE-SmMYB9a毛狀根中丹參酮含量升高了8-35倍,丹酚酸含量降低;而RNAi-SmMYB9a轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹參酮含量降低,丹酚酸含量升高了1.4-2.5倍。OE-SmMYB9a毛狀根中磷濃度下降,低磷響應(yīng)基因的表達被促進,而RNAi-SmMYB9a毛狀根中磷含量升高,低磷響應(yīng)基因的表達被抑制。5.克隆出兩條響應(yīng)低磷脅迫的SPX基因SmSPX2和SmSPX4,其開放閱讀框分別為855 bp和882 bp。通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補技術(shù)發(fā)現(xiàn),SmMYB9a與SmSPX2、SmSPX4都存在互作。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.53
【圖文】：

時間 成分0～10 min 5～20%乙腈10～15 min 20～25%乙腈15～20 min 25%乙腈20～25 min 25～20%乙腈25～28 min 20-30%乙腈28～40 min 30%乙腈40～45 min 45%乙腈45-58min 45%-58%乙腈58-67min 58%-50%乙腈67-70min 50%-60%乙腈70-80min 60%-65%乙腈80-85min 65%-95%乙腈85-95min 95%乙腈95-96min 5%乙腈2.4 實驗結(jié)果2.4.1 低磷對丹參根形態(tài)及生物量的影響

對丹參代謝調(diào)控的影響及其響應(yīng)基因 SmMYB98b 和 SmMYB9a理下丹參植株生長狀況及根形態(tài)如圖 2-1 所示，在理下丹參植株地上部分及地下部分生長狀態(tài)的差部分生長被嚴(yán)重抑制（圖 2-1A），然而地下部分的 2-1B,C）。這也是植物適應(yīng)低磷的一種響應(yīng)，即根，從而增加更多的磷吸收。圖 2-2 可以看出輕度磷量的變化不明顯。

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本文編號：2732140