【摘要】：真菌細(xì)胞壁是位于真菌原生質(zhì)體外的一種動(dòng)態(tài)的剛性結(jié)構(gòu),對(duì)維持細(xì)胞壁的形態(tài)和細(xì)胞正常的生理活動(dòng)起非常重要的作用。在真菌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生改變,主要表現(xiàn)為細(xì)胞壁擴(kuò)張。對(duì)酵母和曲霉細(xì)胞壁的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞壁的擴(kuò)張是在一系列酶的參與下完成的,幾丁質(zhì)酶是其中較為重要的酶類。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶可以促進(jìn)灰蓋鬼傘頂端菌柄細(xì)胞壁的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。幾丁質(zhì)酶促進(jìn)細(xì)胞壁伸長(zhǎng)生長(zhǎng)這種理論是否適用于曲霉菌絲細(xì)胞壁的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)呢?所以本論文研究了幾丁質(zhì)酶ChiB相關(guān)的酶學(xué)特性及該酶在菌絲細(xì)胞壁伸長(zhǎng)生長(zhǎng)中的功能。為研究構(gòu)巢曲霉幾丁質(zhì)酶在曲霉菌絲伸長(zhǎng)生長(zhǎng)中的功能,我們以構(gòu)巢曲霉為研究材料,初步分析了其基因組中幾丁質(zhì)酶基因,并篩選了其中較為重要的基因進(jìn)行重組表達(dá)研究,最終獲得了1個(gè)具有相應(yīng)活性的幾丁質(zhì)酶,并對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)及其生理功能進(jìn)行了研究。以原核表達(dá)系統(tǒng)中的大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主細(xì)胞,成功表達(dá)出了幾丁質(zhì)酶(ChiB)蛋白。幾丁質(zhì)酶片段經(jīng)大腸桿菌密碼子偏好性分析以后,對(duì)片段進(jìn)行優(yōu)化合成,連接到pET28A上形成重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)到大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株中形成重組菌株。重組菌在18℃下經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后表達(dá)出大量的目的蛋白,菌體經(jīng)超聲破碎以后獲得破碎上清,上清經(jīng)Ni-柱層析后純化得到ChiB蛋白,ChiB蛋白分子量大小為45kDa。酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明:1)該酶最適反應(yīng)溫度為50℃,最適反應(yīng)pH環(huán)境為pH6.0;2)最適底物為膠態(tài)幾丁質(zhì)。以乙二醇幾丁質(zhì)為底物時(shí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)為Km=1.99mg/mL,Vmax=0.155μmol·mg-1·min-1;3)ChiB,18家族的幾丁質(zhì)酶,以水解保留機(jī)制對(duì)底物進(jìn)行水解。該幾丁質(zhì)酶分別作用于(GlcNAc)2-6寡糖和幾丁質(zhì)粉末和膠態(tài)幾丁質(zhì)底物,底物和水解產(chǎn)物產(chǎn)物經(jīng)HPAEC-PAD分析,研究結(jié)果表明該酶是外切幾丁質(zhì)酶具有微弱的內(nèi)切活性,并且具有轉(zhuǎn)糖基活性。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究已說(shuō)明能夠水解幾丁質(zhì)粉末的幾丁質(zhì)酶可以促進(jìn)菌柄伸長(zhǎng),本論文的研究結(jié)果進(jìn)一步證明了這一結(jié)論。在體外,該幾丁質(zhì)酶作用于熱滅活的灰蓋鬼傘菌柄伸長(zhǎng)區(qū)域,結(jié)果表明該幾丁質(zhì)酶可以重構(gòu)熱滅活的灰蓋鬼傘菌柄的伸長(zhǎng)。進(jìn)一步希望在構(gòu)巢曲霉體內(nèi)通過(guò)熒光定位的方法確定該幾丁質(zhì)酶在菌絲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中在細(xì)胞內(nèi)的定位,但是在本論文中沒(méi)有觀察到該幾丁質(zhì)酶蛋白在細(xì)胞中的定位,可能是由于該幾丁質(zhì)酶在菌絲發(fā)育中表達(dá)量低。盡管如此,通過(guò)幾丁質(zhì)酶對(duì)熱滅活的灰蓋鬼傘菌柄伸長(zhǎng)區(qū)域的測(cè)定實(shí)驗(yàn),我們推測(cè)該幾丁質(zhì)酶可能參與菌絲細(xì)胞壁的擴(kuò)張,通過(guò)打破細(xì)胞壁中原有的糖鏈結(jié)構(gòu),并在轉(zhuǎn)糖昔酶的作用下形成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。研究細(xì)胞壁相關(guān)的水解酶有利于我們更好的理解在真菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和形態(tài)發(fā)生過(guò)程這些水解酶的功能,同時(shí)為利用這些特定的幾丁質(zhì)酶來(lái)水解外源幾丁質(zhì)和研發(fā)抗真菌藥物和農(nóng)業(yè)上的殺真菌劑提供理論支持。研究這個(gè)課題,對(duì)于控制醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)上病源真菌的增殖或促進(jìn)工業(yè)和農(nóng)業(yè)上生產(chǎn)真菌的生長(zhǎng)具有非常重要的科學(xué)和實(shí)踐意義。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q936;Q78
【圖文】：

圖１．１邋ａ：幾丁質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)（灰色的方框結(jié)構(gòu)代表一個(gè)Ｎ－乙酰葡聚糖胺單體）ｂ：兩種類型的丁質(zhì)鏈：ａ－幾丁質(zhì)和卩－幾丁質(zhì)逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邐（ａ）邋Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｃｈｉｔｉｎ．邋Ｔｈｅ邋ｇｒｅｙ邋ｂｏｘ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｏｎｅ邋Ｎ－ａｃｅｔｌｙｇｌ｜ｉｃｏｓａｍｉｎｅ邋ｓｊｉｂｆｍｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｈｉｔｉｎ邋ｃｈａｉｎ，邋（ｂ）邋Ｔｈｅ邋ｔｗｏ邋ｍａｊｏｒ邋ｔｙｐｅｓ邋ｏｆ邋ｃｈｉｔｉｎ邋ａｒｅ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ邋ｂｙ邋ａｎ邋ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ邋（ａ－ｃｈｉｔｉｎ）邋ｏｒ逡逑ｐａｒａｌｌｅｌ邋（ｐ－ｃｈｉｔｉｎ）邋ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｈａｉｎｓ．逡逑

第一章緒論白逡逑白：在真菌細(xì)胞壁的中含有大量的Ｎ－連接和０－連接的糖蛋白，在許多壁蛋白通過(guò)糖基磷脂酰肌醇錨（ＧＰＩ）粘附在細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上。細(xì)胞菌菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育和真菌形態(tài)的形成。在菌絲正常的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，護(hù)幾丁質(zhì)免受幾丁質(zhì)水解酶的水解作用，Ｊ：說(shuō)ｒｏｖ／ｒ／辦孢子萌發(fā)時(shí)該酶響幾丁質(zhì)水解對(duì)細(xì)胞壁的水解作用。逡逑細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)逡逑細(xì)胞壁主要由糖蛋白、葡聚糖和幾丁質(zhì)組成。幾丁質(zhì)主要位于細(xì)胞膜的穿于整個(gè)細(xì)胞壁，糖蛋白被Ｎ－連接和０－連接的低聚糖修飾，通過(guò)ＧＰＩ到細(xì)胞膜上。糖蛋白，葡聚糖和幾丁質(zhì)相互交聯(lián)形成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)如圖１．２〃５］。逡逑

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本文編號(hào)：2732170