【摘要】：昆蟲病原索科線蟲是一類非常寶貴的昆蟲天敵資源,在蔬菜、農(nóng)林及衛(wèi)生害蟲生物防治方面具有很好的應(yīng)用前景。該類線蟲的性別分化較為特殊,寄生期的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)壓力決定其雌、雄性別分化(屬環(huán)境決定型),然而目前有關(guān)動(dòng)物這一特殊性別分化的分子機(jī)理研究的較少。本課題組前期利用秀麗線蟲(Caenorhabdiris elegans)相關(guān)研究背景,對(duì)蚊類病原武昌羅索線蟲(Romanomermis wuchangennsis)的寄生后期幼蟲(J4)和成蟲進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析并篩選到部分相關(guān)性別分化基因,但并未對(duì)性別分化關(guān)鍵的寄生期幼蟲(J3)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,其相關(guān)性別分化基因的功能也缺乏更深入的研究。因此,進(jìn)一步探討影響武昌羅索線蟲性別分化基因及其功能具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本研究首先觀察了武昌羅索線蟲寄生期幼蟲(J3)在宿主致倦庫(kù)蚊孑孓體內(nèi)寄生的系列形態(tài)變化,探明了線蟲與宿主感染比例及寄生后期幼蟲脫出時(shí)間等因素對(duì)該線蟲雌、雄性別分化或比例的影響。然后取材雌、雄武昌羅索線蟲不同寄生期幼蟲(J3)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。最后依據(jù)秀麗線蟲性別決定通路,篩選性別相關(guān)基因,采用熒光定量PCR、RNA干擾及原位雜交等技術(shù)對(duì)部分基因進(jìn)行功能研究,探究基因在線蟲不同發(fā)育期的表達(dá)量及干擾后對(duì)其性別分化的影響。其結(jié)果如下。1.寄生期幼蟲形態(tài)及生物學(xué)觀察為了解武昌羅索線蟲寄生期幼蟲及其宿主的形態(tài)變化,本研究利用體視顯微鏡對(duì)感染后的孑孓進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)從線蟲寄生的第5天開始,孑孓體內(nèi)胸部纏繞有寄生期幼蟲;解剖孑孓發(fā)現(xiàn):線蟲在寄生3天后其體長(zhǎng)成倍增長(zhǎng),第5天的寄生期幼蟲體內(nèi)滋養(yǎng)物體開始大量堆積。線蟲完成寄生期的生長(zhǎng)發(fā)育后從宿主體內(nèi)脫出并導(dǎo)致孑孓死亡,脫出的寄生后期幼蟲外形已出現(xiàn)明顯的性別特征,能明顯觀察到雌性個(gè)體較雄性的大,在體視顯微鏡下能清楚看到雌性個(gè)體身體中前部的陰道口。對(duì)線蟲寄生時(shí)間和感染比例進(jìn)行研究結(jié)果表明:在26 ℃培養(yǎng)條件下,最早在寄生第6天脫出的線蟲均為個(gè)體較小的雄性寄生后期幼蟲,寄生第8天后脫出的均為體型較大的雌性寄生后期幼蟲。感染比例(線蟲:孑孓)為1:1時(shí)脫出的線蟲全為雌蟲,感染比例為40:1時(shí)脫出的線蟲全部發(fā)育為雄蟲。即:宿主體內(nèi)寄生的線蟲越多,每條線蟲所能獲得的營(yíng)養(yǎng)越少,越有可能發(fā)育為雄蟲;相反則發(fā)育成雌蟲。2.寄生期幼蟲的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序通過對(duì)所選用寄生3d、4d、5d雌雄幼蟲分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并結(jié)合本課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果,同時(shí)參照模式線蟲的性別決定通路篩選出fox-1、tra-2、laf1、tra-3、fem-1、tra-1、mab-3、mab-7、mab-5、gld-1、egl-4 等 11 個(gè)與性別分化相關(guān)的基因。課題組前期已對(duì)laf-1、mab-3、tra-2等基因進(jìn)行了初步研究,在此基礎(chǔ)上,本研究選取以下4個(gè)基因fem-1、fox-1、mab-7、tra-1進(jìn)行更進(jìn)一步的功能分析。3.武昌羅索線蟲性別分化候選基因的功能研究(1)Rwufem-1、Rwufox-1、Rwumab-7和Rwutra-1 基因序列分析利用生物信息學(xué)構(gòu)建N-J進(jìn)化樹進(jìn)行序列多重比對(duì),結(jié)果顯示Rwufem-1、Rwufox-1、Rwumab-7和Rwutra-1 個(gè)基因均與中華卵索線蟲(Ovomermis sinensis)的聚為同一枝,親緣關(guān)系最近。(2)Rwufem-1、Rwufox-1、Rwumab-7和Rwumab-1的熒光定量 PCR熒光定量結(jié)果顯示:①Rwufem-1基因在3天寄生期幼蟲及雌、雄成蟲相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)極顯著差異(p0.01),7天寄生后期雌、雄幼蟲間相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)顯著差異(p0.05);②Rwufox-1基因在3天寄生期幼蟲、1天寄生后期雌雄幼蟲相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)顯著差異(p0.05);③Rwumab-7基因在3天、5天寄生期幼蟲,1天寄生后期雌雄幼蟲相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)極顯著差異(p0.01),5、7天寄生后期幼蟲相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)顯著差異(p0.05);④Rwutra-1基因在3天寄生期雌、雄幼蟲及成蟲相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)極顯著差異(p0.01),在5天寄生后期幼蟲基因表達(dá)量出現(xiàn)顯著差異(p0.05)。(3)Rwufem-1、Rwufox-1、Rwumab-7 和 Rwutra-1 的 RNAi 實(shí)驗(yàn)RNAi結(jié)果顯示:①干擾Rwufem-1基因后,脫出線蟲的雌、雄性比與對(duì)照組相比明顯增加且差異極顯著(P0.01),表明Rwufem-1基因被干擾后幼線蟲朝向雌性化發(fā)育;②Rwufox-1基因干擾后,線蟲雌、雄性比減小且差異極顯著(p0.01),表明Rwufox-1基因被干擾后幼線蟲偏向雄性化發(fā)育;③Rwumab-7基因干擾后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比沒有差異(p0.05),推測(cè)可能與dsRNA長(zhǎng)度和位置不合適等因素有關(guān);④干擾Rwutra-1基因后脫出線蟲的雌、雄性比與對(duì)照組相比明顯增加且差異極顯著(p0.01),表明Rwutra-1基因被干擾后線蟲朝向雌性化發(fā)育。(4)Rwufem-1、Rwufox-1、Rwumab-7和Rwutra-1的原位雜交實(shí)驗(yàn)原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:①Rwufem-1原位雜交結(jié)果顯示該基因在雌性成蟲中少量表達(dá),雜交信號(hào)較弱;在雄性成蟲中大量表達(dá),且越靠近線蟲尾部雜交信號(hào)越強(qiáng),該基因可能對(duì)雄性精子發(fā)育起重要作用,推測(cè)武昌羅索線蟲在寄生第3天時(shí)啟動(dòng)雄性性別分化。②Rwufox-1原位雜交結(jié)果顯示:該基因在雌性成蟲中大量表達(dá),雜交信號(hào)較強(qiáng);在雄性成蟲中少量表達(dá),雜交信號(hào)較弱;推測(cè)Rwufox-1基因與武昌羅索線蟲雌性配子的發(fā)育有關(guān)。③Rwumab-7原位雜交結(jié)果顯示該基因在雌性成蟲中少量表達(dá),雜交信號(hào)較弱;在雄性成蟲中大量表達(dá),雜交信號(hào)較強(qiáng);推測(cè)Rwumab-7參與雄性的發(fā)育、雄配子的形成以及雄性性腺的發(fā)育過程。④Rwutra-I原位雜交結(jié)果顯示該基因在雌性成蟲中少量表達(dá),雜交信號(hào)較弱;在雄性成蟲中大量表達(dá),雜交信號(hào)較強(qiáng);推測(cè)Rwutra-1可能與武昌羅索線蟲雄性線蟲的生殖腺發(fā)育有關(guān)。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析,本研究對(duì)線蟲和宿主進(jìn)行了形態(tài)觀察,驗(yàn)證了武昌羅索線蟲性別決定發(fā)生于寄生期,另外線蟲寄生時(shí)間的長(zhǎng)短和感染比例高低的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該線蟲的性別分化與其寄生期所獲營(yíng)養(yǎng)的多少有關(guān)。在此基礎(chǔ)上,通過熒光定量、RNA干擾、原位雜交等實(shí)驗(yàn)方法初步探明了上述4個(gè)基因:推測(cè)Rwufem-1、Rwumab-7和Rwutra-1可能參與雄性武昌羅索線蟲的發(fā)育;Rwufox-1基因與雌性線蟲的發(fā)育有關(guān)。本研究結(jié)果為后續(xù)索科線蟲性別分化與性別決定通路的研究提供了素材和科學(xué)數(shù)據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S476.15
【圖文】：

３．１武昌羅索線蟲寄生在孑孓體內(nèi)的形態(tài)變化逡逑將寄生線蟲的孑孓放置冰上冷凍３０邋ｍｉｎ，置于載玻片上用解剖針挑破孑孓體逡逑壁，挑出線蟲，在寄生第３天時(shí)解剖出的線蟲體型特別�。▓D３．１邋Ａ），隨著寄生逡逑時(shí)間的增加，線蟲在孑孓體內(nèi)迅速生長(zhǎng)，直至完成寄生生活從孑孓體內(nèi)脫出（圖３．１逡逑Ｆ）邋0逡逑］逡逑ＡＢＣ逡逑Ｄ邐Ｅ邐Ｆ逡逑圖３．１武昌羅索線蟲寄生在孑孓體內(nèi)的形態(tài)逡逑Ｆｉｇ．邋３．１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｐａｒａｓｉｔｉｃ邋ｊｕｖｅｎｉｌｅｓ逡逑Ａ：第３天寄生期線蟲；Ｂ：第４天寄生期線蟲；Ｃ：第５天寄生期

３．１武昌羅索線蟲寄生在孑孓體內(nèi)的形態(tài)變化逡逑將寄生線蟲的孑孓放置冰上冷凍３０邋ｍｉｎ，置于載玻片上用解剖針挑破孑孓體逡逑壁，挑出線蟲，在寄生第３天時(shí)解剖出的線蟲體型特別�。▓D３．１邋Ａ），隨著寄生逡逑時(shí)間的增加，線蟲在孑孓體內(nèi)迅速生長(zhǎng)，直至完成寄生生活從孑孓體內(nèi)脫出（圖３．１逡逑Ｆ）邋0逡逑］逡逑ＡＢＣ逡逑Ｄ邐Ｅ邐Ｆ逡逑圖３．１武昌羅索線蟲寄生在孑孓體內(nèi)的形態(tài)逡逑Ｆｉｇ．邋３．１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｐａｒａｓｉｔｉｃ邋ｊｕｖｅｎｉｌｅｓ逡逑Ａ：第３天寄生期線蟲；Ｂ：第４天寄生期線蟲；Ｃ：第５天寄生期

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本文編號(hào)：2730699