【摘要】：玉米是全世界最重要的作物之一。東北地區(qū)作為我國玉米的主要產(chǎn)區(qū),由于地理位置和氣候因素的影響,玉米生產(chǎn)經(jīng)常遭受冷害,導(dǎo)致玉米相關(guān)生理機(jī)能受損,代謝抑制,引起氧化、高滲及發(fā)育緩慢,嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量。因此通過遺傳改良等方法提高玉米的冷脅迫適應(yīng)能力就顯得尤為重要。針對以上問題,本研究對玉米耐冷相關(guān)基因ZmGDH2(玉米谷氨酸脫氫酶基因)進(jìn)行了克隆、功能驗證及遺傳轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果如下:1.通過RT-PCR技術(shù),從抗冷玉米自交系W9816中成功克隆到1236bp的ZmGDH2編碼序列,其編碼含411個氨基酸的功能蛋白。染色體定位分析發(fā)現(xiàn)ZmGDH2位于10號染色體,基因全長4453bp,包含9個外顯子。以海棲熱袍菌GDH(PDB:1B3B)為蛋白模板,構(gòu)建了玉米GDH2蛋白三維結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)玉米GDH2具備相對較高的柔性和較差的熱穩(wěn)定性,適于在低溫環(huán)境下發(fā)揮作用。利用DNAMAN對多種植物的谷氨酸脫氫酶的氨基酸序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)GDH2蛋白具有較強(qiáng)的保守性,玉米GDH2與高粱等作物GDH2相似性高達(dá)88%以上。2.以抗冷玉米自交系W9816為實驗材料,利用qRT-PCR方法,分別測定其在4℃處理0h、6h、12h、24h和48h后,ZmGDH2基因在根、莖、葉等組織中的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在不同組織中,ZmGDH2基因?qū)Σ煌幚頃r長的冷脅迫響應(yīng)存在顯著的差別,其中在葉中響應(yīng)最為明顯。3.構(gòu)建了ZmGDH2基因的過表達(dá)載體pCHF3300-35S-ZmGDH2,并獲得了過表達(dá)ZmGDH2基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥材料。以野生型擬南芥和純合突變體為參照,對轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行耐冷表型鑒定及丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Pro)含量和過氧化物歧化酶(POD)活性等相關(guān)生理指標(biāo)的測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ZmGDH2基因提高了擬南芥植株對冷脅迫的耐受力。4.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對玉米骨干自交系Y423的幼胚和愈傷進(jìn)行了ZmGDH2基因的遺傳轉(zhuǎn)化。侵染幼胚共獲再生植株607株,PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)化植株29株,陽性轉(zhuǎn)化率為4.78%;侵染愈傷共獲再生植株944株,PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)化植株34株,陽性轉(zhuǎn)化率為3.6%。對T0代轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行qRT-PCR分析,發(fā)現(xiàn)ZmGDH2基因在陽性轉(zhuǎn)化植株中的表達(dá)量顯著高于對照。5.對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基(共培養(yǎng)培養(yǎng)基和重懸液)內(nèi)每升加入10g葡萄糖,轉(zhuǎn)化效率可以從4.32%提高到5.06%;侵染前對受體材料進(jìn)行3min 45℃熱激處理,幼胚轉(zhuǎn)化率從3.70%提高到6.25%,愈傷轉(zhuǎn)化率從2.85%提高到3.93%。6.利用花粉管通道法對玉米骨干自交系10Z27進(jìn)行ZmGDH2基因遺傳轉(zhuǎn)化,獲得T0代玉米12穗,共計6956粒。T0代植株經(jīng)噴施0.15%Basta溶液篩選和PCR鑒定,共獲得陽性植株76株,轉(zhuǎn)化率為1.1%。對T0代植株進(jìn)行自交授粉,現(xiàn)已收獲T1代種子2798粒。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2;S513

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2730612