BmCPV circRNAs功能及過表達(dá)BmCPV單基因?qū)Σ《驹鲋车挠绊?/H1>
發(fā)布時(shí)間：2020-06-25 13:05
【摘要】：隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的進(jìn)步,越來越多的circRNAs(circular RNAs)被發(fā)現(xiàn)。并已證實(shí)一些circRNAs具有結(jié)合miRNAs、與RNA結(jié)合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)互作、參與基因轉(zhuǎn)錄、剪接調(diào)控等多種多樣的功能,并在細(xì)胞增殖、分化、存活、衰老等許多生命過程和多種疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。家蠶細(xì)胞質(zhì)型多角體病毒(Bombyx mori cypovirus,BmCPV)是CPV1型的典型種,能感染家蠶中腸細(xì)胞,導(dǎo)致家蠶發(fā)生質(zhì)型多角體病引起養(yǎng)蠶歉收。病毒作為生物體的一大類,是人類、動(dòng)物和植物重要疾病的病原,但至今沒有病毒的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成circRNAs的有關(guān)報(bào)道。本研究中,通過高通量測(cè)序在BmCPV感染的家蠶中腸組織中發(fā)現(xiàn)有295種BmCPV來源的circRNAs。這些circRNAs分子大小分布在100-3800 nt,主要集中在200-1000 nt。circRNAs來源上在Bm CPV基因組的10個(gè)片段都有分布,但主要分布在基因組正鏈上。在對(duì)BmCPV circRNAs連接位點(diǎn)兩側(cè)的剪接信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn),病毒circRNAs的形成并不遵循典型的GT-AG拼接規(guī)則,并且在基因組正負(fù)鏈上也各不相同。GO和KEGG分析顯示,BmCPV circRNAs可能通過與miRNA互作,調(diào)節(jié)細(xì)胞的蛙皮素受體信號(hào)通路、果糖2,6-二磷酸代謝過程、MAPK信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路等。通過PCR產(chǎn)物測(cè)序、Northern blot進(jìn)一步確認(rèn)了BmCPV感染的家蠶中腸組織中存在BmCPV病毒來源的circRNAs。另外,本研究還發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)BmCPV單基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、BmCPV病毒粒子中都檢測(cè)到病毒來源的circRNAs。這些新發(fā)現(xiàn)證明,BmCPV通過反向剪接形成功能性circRNA,為理解病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、病毒與宿主的互作提供了新的視角。為了更好地闡釋病毒產(chǎn)生circRNAs的功能及作用機(jī)制,又對(duì)Bm CPV circ_048開展了更進(jìn)一步的研究。qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)circ_048是在BmCPV感染BmN細(xì)胞12小時(shí)后開始形成,并逐步累積。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,circ_048定位在BmN細(xì)胞質(zhì)中。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,上調(diào)circ_048水平可抑制Bm CPV的增殖,同時(shí)還上調(diào)了家蠶先天免疫相關(guān)基因絲氨酸/蘇氨酸-蛋白質(zhì)磷酸酶的表達(dá)水平。另外,通過RNA pull down與質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn),circ_048有可能與Elongation factor 1-alpha、ATP synthase subunit beta等蛋白互作。信息學(xué)分析顯示,circ_048具有IRES序列,具有編碼6種多肽ORF-V,ORF-1,ORF-2,ORF-3,ORF-4和ORF-5的可能。進(jìn)一步人工合成上述多肽的抗原肽、制備混合抗體,細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,circ_048可能具有編碼多肽的潛能。同時(shí),還發(fā)現(xiàn)ORF-3、ORF-5起源的抗原肽都能夠抑制BmCPV病毒的增殖,ORF-5起源的抗原肽可誘導(dǎo)細(xì)胞聚集、呈現(xiàn)病理變化。這些結(jié)果初步表明circ_048的RNA可通過與蛋白互作、編碼小肽發(fā)揮功能。BmCPV的S1-S10 dsRNAs基因組片段為單順反子,每個(gè)基因組片段在病毒增殖復(fù)制中的作用仍不清楚。研究了過表達(dá)BmCPV的vp3、vp7、polh及其相應(yīng)的無起始密碼子的vp3-mut、vp7-mut和polh-mut基因,及S2和S5片段對(duì)BmCPV增殖復(fù)制的影響,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)vp7、vp7-mut都能促進(jìn)BmCPV的增殖,過表達(dá)S5(NSP5)能夠抑制BmCPV的增殖,但沒有發(fā)現(xiàn)過表達(dá)vp3/vp3-mut、polh/polh-mut對(duì)病毒增殖的影響。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,過表達(dá)vp3/vp3-mut、vp7/vp7-mut對(duì)細(xì)胞免疫、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)無明顯影響。另外,細(xì)胞流式發(fā)現(xiàn),過表達(dá)S5(NSP5)還能夠促進(jìn)BmN細(xì)胞由S期向G2期轉(zhuǎn)換。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S884.51
【圖文】：
型多角體病毒( Bombyx mori cytoplasmic polyhedosis virus病毒科( Reovirdae )質(zhì)型多角體病毒屬( Cypovirus ) I 型病( dsRNA)病毒[1]。CPV 的結(jié)構(gòu)特征V 是一種球狀的病毒，具有二十面體結(jié)構(gòu)（12 個(gè)頂點(diǎn)），在 12 個(gè)頂點(diǎn)處各有 1 個(gè)塔狀突起[2]。突起被分為由 A 和與頂部的球狀小體相連，B 突起與病毒衣殼直接相連[3]。圖過負(fù)染和冷凍電鏡技術(shù)得到的 BmCPV 的結(jié)構(gòu)圖。其中冷yo-electron microscopy，cryo-EM），簡(jiǎn)稱冷凍電鏡，是利用物大分子后，在低溫中用透射電子顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行成像究發(fā)現(xiàn) BmCPV 頂點(diǎn)上的 A 和 B 突起結(jié)構(gòu)與 mRNA 的釋的結(jié)構(gòu)是一種中空的管狀，所以研究者推斷 BmCPV 的 起以及 A、B 突起之間的腔隙來進(jìn)出病毒粒子。
mCPV 電鏡下多角體形態(tài)（余學(xué)奎等Fig.1-2 Shapes of the BmCPV polyhed株系PV 多角體的形狀、多角體在細(xì)胞中括野生型的 H 株和 8 株突變株（I、]：表 1-1 BmCPV 不同株系Table 1-1 Different strains of BmC多角體位置 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核 細(xì)胞質(zhì) 細(xì)胞核 細(xì)胞核 【參考文獻(xiàn)】
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1 李曉東;李彥姝;趙大林;李豐;;p21活化激酶的生物學(xué)活性及其與腫瘤的關(guān)系[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2006年03期
2 孫京臣,譚玉蓉,戴偉君,張勤奮,徐興耀,張景強(qiáng);家蠶質(zhì)多角體病毒RDRP的免疫電鏡定位研究[J];電子顯微學(xué)報(bào);2005年01期
3 鐘伯雄;家蠶質(zhì)型多角體病毒的三磷酸核苷酸結(jié)合蛋白[J];蠶業(yè)科學(xué);2001年01期
4 余學(xué)奎,張勤奮,張景強(qiáng);家蠶質(zhì)多角體病毒(BmCPV)的結(jié)構(gòu)研究[J];電子顯微學(xué)報(bào);1998年04期
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1 郭睿;BmBDV、BmCPV反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的建立及不同抗性家蠶對(duì)BmCPV的感染應(yīng)答[D];蘇州大學(xué);2015年
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2 張軼嶺;BmCPV與BmNPV多角體對(duì)異源蛋白的包埋特性研究[D];蘇州大學(xué);2011年
3 孟祥坤;BmCPV-SZ全基因組序列測(cè)定與分析及其多角體蛋白包裝特性的研究[D];蘇州大學(xué);2010年
本文編號(hào)：2729177
本文鏈接：http://sikaile.net/kejilunwen/jiyingongcheng/2729177.html
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S884.51
【圖文】：
型多角體病毒( Bombyx mori cytoplasmic polyhedosis virus病毒科( Reovirdae )質(zhì)型多角體病毒屬( Cypovirus ) I 型病( dsRNA)病毒[1]。CPV 的結(jié)構(gòu)特征V 是一種球狀的病毒，具有二十面體結(jié)構(gòu)（12 個(gè)頂點(diǎn)），在 12 個(gè)頂點(diǎn)處各有 1 個(gè)塔狀突起[2]。突起被分為由 A 和與頂部的球狀小體相連，B 突起與病毒衣殼直接相連[3]。圖過負(fù)染和冷凍電鏡技術(shù)得到的 BmCPV 的結(jié)構(gòu)圖。其中冷yo-electron microscopy，cryo-EM），簡(jiǎn)稱冷凍電鏡，是利用物大分子后，在低溫中用透射電子顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行成像究發(fā)現(xiàn) BmCPV 頂點(diǎn)上的 A 和 B 突起結(jié)構(gòu)與 mRNA 的釋的結(jié)構(gòu)是一種中空的管狀，所以研究者推斷 BmCPV 的 起以及 A、B 突起之間的腔隙來進(jìn)出病毒粒子。
mCPV 電鏡下多角體形態(tài)（余學(xué)奎等Fig.1-2 Shapes of the BmCPV polyhed株系PV 多角體的形狀、多角體在細(xì)胞中括野生型的 H 株和 8 株突變株（I、]：表 1-1 BmCPV 不同株系Table 1-1 Different strains of BmC多角體位置 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核 細(xì)胞質(zhì) 細(xì)胞核 細(xì)胞核
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本文編號(hào)：2729177
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