發(fā)布時間：2020-06-25 08:07

【摘要】：白血病(Leukemia)是一種造血系統(tǒng)高發(fā)性惡性腫瘤,也是小兒患者中最常見的惡性腫瘤。雷帕霉素治療白血病有一定的療效。BCL11B(B-cell lymphoma/leukemia 11B)屬于BCL家族,是一種非常重要的轉錄調控因子。BCL11B基因參與胸腺發(fā)生、T細胞增殖和分化等生物過程,同時也調控淋巴造血系統(tǒng)發(fā)育,增殖。其缺失容易產生輻射誘導白血病的發(fā)生。染色質構象俘獲(chromosome conformation capture 3C)技術研究細胞核內的染色質空間組織,同時也可以研究遠距離DNA分子間的相互作用。染色質免疫共沉淀技術(Chromatin Immunoprecipitation ChIP),是現階段作為研究DNA-蛋白質間的相互作用的一種有力工具。當3C、ChIP及甲醛輔助分離調控元件(Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements FAIRE)技術、組蛋白修飾技術相結合時,可以促進人們對細胞核內部結構的認識,細胞核染色質間的相互作用是復雜多樣的,而這些技術可以幫助我們來研究染色質間的相互作用。本研究利用3C、ChIP及甲醛輔助分離調控元件(FAIRE)等技術方法,可以從三維水平上認識雷帕霉素對T細胞急性白血病細胞內BCL11B基因座位動態(tài)空間組織的影響,進而研究BCL11B基因在T細胞急性白血病細胞內表達調控的分子機制。目的:研究雷帕霉素對T細胞急性白血病細胞內BCL11B基因座位動態(tài)空間組織的影響,進而研究BCL11B基因在T細胞急性白血病細胞內表達調控的分子機制。方法:1.細胞常規(guī)培養(yǎng)條件下,細胞生長處于對數增長期時,選取合適濃度的雷帕霉素處理CD4+T細胞(Jurkat細胞),用MTT測定細胞活力。2.通過熒光定量PCR(qPCR)、Western Blot檢測Jurkat細胞用不同濃度雷帕霉素處理24 h后相關基因的轉錄水平及蛋白表達水平。3.通過3C技術研究Jurkat細胞用雷帕霉素處理前后,BCL11B基因座位內位點間的相互作用的變化。4.通過FAIRE技術研究Jurkat細胞用雷帕霉素處理前后,BCL11B基因座位開放區(qū)位點之間的變化。5.通過ChIP技術研究Jurkat細胞用雷帕霉素處理前后,BCL11B基因座位與CTCF蛋白相關位點之間的相互作用的變化。6.通過ChIP技術研究Jurkat細胞用雷帕霉素處理前后,BCL11B基因座位上組蛋白修飾水平變化。結果:1.通過MTT活力測定結果顯示,雷帕霉素能抑制Jurkat細胞的增殖活力,抑制程度與藥物濃度呈正相關;Jurkat細胞用雷帕霉素處理后,BCL11B與CTCF的轉錄水平及表達水平均不同程度上調。2.3C研究證明了BCL11B基因座位各位點間存在相互作用的關系,并且雷帕霉素激發(fā)了Jurkat細胞BCL11B空間組織動態(tài)變化。3.FAIRE對BCL11B基因座位各位點的富集效率不同,且雷帕霉素激發(fā)了Jurkat細胞BCL11B基因座位活躍性。4.雷帕霉素影響了Jurkat細胞CTCF與BCL11B基因座位結合的頻率。5.雷帕霉素影響了Jurkat細胞BCL11B基因座位上組蛋白修飾水平。結論:雷帕霉素處理改變了Jurkat細胞內的表觀遺傳環(huán)境,進而激發(fā)了BCL11B基因座位的空間組織變化,BCL11B基因座位這種空間組織的變化在功能上調控了基因的表達。
【學位授予單位】：海南醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R733.7
【圖文】：

床孵育 PVDF 膜 1 h。（12）曝光照相：取出 PVDF 膜，用 TBST 中洗滌 6 次，每次 5 min。將 A、B 工作液按 1:1 混勻（見超敏 ECL 化學發(fā)光試劑盒說明書）滴于膜上，曝光照相。1.3 實驗結果1.3.1 雷帕霉素抑制 Jurkat 細胞的增殖活力Jurkat 細胞常規(guī)條件下培養(yǎng)至細胞對數生長期，96 孔板鋪板，用計數板計數，使每孔細胞數控制在10000個左右，Jurkat 細胞經過不同濃度雷帕霉素處理24 h，根據測得的 OD 值計算出抑制率，結果用 GraphPad Prism 5 軟件制圖，如圖 1.1所示，細胞增殖活力明顯抑制，并且隨著藥物濃度的增加，細胞活力抑制程度明顯增加。實驗結果用 SPSS 軟件做統(tǒng)計學分析，p<0.05，具有統(tǒng)計學意義。實驗結果說明雷帕霉素抑制 Jurkat 細胞的增殖。

海南醫(yī)學院碩士學位論文at 細胞不同濃度雷帕霉素處理后相關基因的轉錄水平上 細胞常規(guī)條件下培養(yǎng)至細胞對數生長期，用 0、10 ng/m雷帕霉素處理 Jurkat 細胞 24 h 后，收集細胞，提取總 RRNA 進行用凝膠電泳分析，如圖 1.2 所示，可見兩條明 提取效果較好，無明顯降解，進一步進行反轉錄，得到

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本文編號：2729100