【摘要】：抽薹開花是十字花科作物從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長關(guān)鍵階段。它是內(nèi)源因素與外界環(huán)境共同作用的結(jié)果,適期抽薹對(duì)于作物適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂蛑陵P(guān)重要。因環(huán)境條件和自身遺傳等因素,生產(chǎn)上先期抽薹現(xiàn)象較多,嚴(yán)重影響了作物產(chǎn)量和品質(zhì)。烏菜是十字花科大白菜的一個(gè)變種,極耐低溫,以富含維生素C而聞名。作為江淮一帶廣泛栽培的蔬菜品種,烏菜先期抽薹問題一直困擾著眾多種植者,而培育耐抽薹烏菜品種正是解決該問題的有效途徑,掌握烏菜抽薹開花的分子機(jī)制,對(duì)培育耐抽薹品種意義重大。十字花科作物抽薹開花可由多個(gè)途徑控制,但大部分途徑都作用于FLOWERING LOCUS C(FLC)與SHORT VEGETATIVE PAHSE(SVP)基因,FLC基因編碼一個(gè)MADS-box蛋白,與下游基因啟動(dòng)子結(jié)合,是一個(gè)成花抑制因子。FLC可與SVP形成蛋白復(fù)合體,共同影響下少游FLOWERING LOCUS T(FT)與SUPPERSSOR OF OVEREXPRESSION CONSTANS 1(SOC1)等的表達(dá),進(jìn)而控制作物的抽薹開花。本實(shí)驗(yàn)通過克隆兩個(gè)烏菜品種W-1(耐抽薹)與W-2(不耐抽薹)的FLC1基因來分析品種間抽薹性狀差異的原因,主要研究結(jié)果如下:1.成功從烏菜兩個(gè)品種中克隆出了FLC1基因,經(jīng)BLAST分析與歐洲油菜FLC1基因相似度最高,命名為BcFLC1-1及BcFLC1-2,兩個(gè)基因長591bp,共編碼196個(gè)氨基酸,經(jīng)預(yù)測該基因編碼一個(gè)MADS盒和K-Box盒;BcFLC1基因內(nèi)有兩個(gè)堿基突變,且后一個(gè)堿基的突變造成第174位氨基酸突變。成功從兩個(gè)品種烏菜中克隆出SVP基因,長726 bp,編碼241個(gè)氨基酸。2.在線預(yù)測結(jié)果表明BcFLC1基因定位于細(xì)胞核內(nèi),同時(shí),設(shè)計(jì)引物成功構(gòu)建了pBI121-35S::BcFLC1-GFP表達(dá)載體,并利用EHA105農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞,進(jìn)行亞細(xì)胞定位,證實(shí)其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。3.通過實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)分析了BcFLC1、SVP、SOC1、FT在烏菜中的時(shí)空表達(dá)模式,FLC1與SVP基因在同一時(shí)期內(nèi)兩個(gè)品種間表達(dá)量沒有明顯差異,但SOC1與FT基因表達(dá)量差異較大,晚抽薹品種W-1的SOC1與FT基因表達(dá)量顯著低于不耐抽薹品種W-2。此外,隨著時(shí)間的增加,FLC1與SVP基因在兩個(gè)品種內(nèi)均呈現(xiàn)下降趨勢,FT基因與SOC1基因則呈現(xiàn)上升趨勢。花期時(shí),FLC1與SVP基因在根及莖組織中表達(dá)較高,在葉片、花及蕾中表達(dá)量極低;FT與SOC1基因在根系中表達(dá)量較低,在花器官中表達(dá)極高。4.為了分析基因點(diǎn)突變對(duì)FLC1與SVP的互作造成的影響,采用酵母雙雜技術(shù),將BcFLC1基因插入pGBKT7載體并轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母菌株,將SVP基因插入pGADT7載體并轉(zhuǎn)化Y187酵母菌株,經(jīng)檢測載體無自激活與自毒現(xiàn)象;酵母雙雜結(jié)果表明點(diǎn)突變沒有完全破壞FLC1與SVP基因之間的互作,但突變導(dǎo)致二者之間的互作程度降低。5.為了分析互作程度的降低對(duì)抽薹的影響,設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建了BcFLC1基因的植物超表達(dá)載體pBI121-35S::BcFLC1,利用農(nóng)桿菌作介導(dǎo),用花序侵染法成功侵染并篩選得到了35S::BcFLC1-1轉(zhuǎn)基因3個(gè)T_0代植株,35S::BcFLC1-2轉(zhuǎn)基因2個(gè)T_0代植株;經(jīng)篩選種植,在T_3代中得到35S::BcFLC1-1株系共計(jì)29棵植株,35S::BcFLC1-2株系共計(jì)26棵植株,抽薹統(tǒng)計(jì)表明35S::BcFLC1-1株系抽薹時(shí)間晚且葉片數(shù)增多。熒光定量PCR結(jié)果顯示,與野生型植株相比轉(zhuǎn)基因植株中FT基因與SOC1基因表達(dá)量較低,且35S::BcFLC1-1轉(zhuǎn)基因株系中FT與SOC1基因表達(dá)量下降十分明顯。因此,BcFLC1基因點(diǎn)突變可影響其與SVP基因之間的互作,繼而影響到下游成花整合因子FT及SOC1基因的表達(dá)量,最終導(dǎo)致植株晚抽薹。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S634
【圖文】：

圖 1-1 擬南芥中 FLC 調(diào)節(jié)抽薹開花示意圖（引自 Daniel J[71]）Fig. 1-1 Diagram illustrating regulation of FLOWERING LOCUS C(FLC)擬南芥中，SVP 基因也是一個(gè)開花網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵中心基因，在自主途徑、GSVP 蛋白與 SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1（SOERING LOCUS T（FT）的啟動(dòng)子區(qū)域相關(guān)聯(lián)，并與其中 FLC 結(jié)合。在LC 基因與 SVP 基因形成蛋白復(fù)合物，以抑制 SOC1 和 FT 基因的花發(fā)通子的表達(dá)，進(jìn)而抑制擬南芥開花[72, 73]。VP 在營養(yǎng)生長期間一直與 FLC 在體內(nèi)相互作用，并且它們的功能是相LC 功能缺失能減弱 SVP 過表達(dá)造成的晚花表型，相反，SVP 功能缺失 FLC 過表達(dá)造成的晚花表型，SVP 和 FLC 之間的蛋白互作對(duì)于抑制 是必需的，決定了花卉通路整合子響應(yīng)各種內(nèi)源和環(huán)境信號(hào)的表達(dá)[74]。F用酵母雙雜證明了 FLC 與 SVP 存在互作，且通過減少 SVP 的積累以減成復(fù)合物，可以減弱對(duì) FT 表達(dá)的抑制作用。

圖 4-1 烏菜 cDNA 內(nèi)參基因檢測結(jié)果Fig. 4-1 Amplification product of Actin注：M，DL2000 Maker; 1, W-1；2, W-2Note: M, DL2000 Maker; 1, W-1; 2, W-2.因克隆果如圖 4-2 所示， SVP 基因LAST 分析，與歐洲油菜 (Bra FLC1 基因大小為 591 bp，共LC1 為 21.98 KD，等電點(diǎn)均為大小均為 726 bp，共編碼 241

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1 張雷;BcFLC1基因點(diǎn)突變延遲烏菜抽薹的分子機(jī)理[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

2 榮子龍;不結(jié)球白菜晚抽薹基因BcFLC1，BcFLC3的克隆及表達(dá)分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2727039