發(fā)布時(shí)間：2020-06-23 06:14

【摘要】：原發(fā)性肝癌(primary liver cancer,PLC,以下簡(jiǎn)稱肝癌)作為一種惡性腫瘤,對(duì)人們的身體健康和生活質(zhì)量有著嚴(yán)重的威脅。肝癌是全球第六大癌癥,亦位居我國(guó)癌癥中的第二位,全球50%以上的肝癌都發(fā)生在我國(guó)。手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療、生物治療、中醫(yī)中藥治療等是目前治療肝癌的主要臨床方法,但肝癌作為一種有高侵襲性的惡性腫瘤,早期癥狀不明顯,患者一經(jīng)診斷往往已屬于晚期,因此目前肝癌的治療效果和整體預(yù)后仍然很差。近年來,隨著對(duì)分子生物學(xué)和腫瘤學(xué)研究的不斷深入,選擇分子靶向性治療腫瘤的方法成為了一種新的理想策略。細(xì)胞凋亡是一種由多種基因共同調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過程,通過激活腫瘤細(xì)胞凋亡途徑可成為治療腫瘤的一種方式。Bcl-2蛋白家族對(duì)細(xì)胞的凋亡進(jìn)程起著調(diào)控作用。近年來發(fā)現(xiàn)的Noxa與Puma蛋白同屬于Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白亞家族BH3-only蛋白家族中的兩種促凋亡蛋白,具有較強(qiáng)的促凋亡作用。端粒酶是目前已知的最廣譜的腫瘤標(biāo)志物,人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRET)是端粒酶的組成部分之一,并是端粒酶激活的關(guān)鍵限速步驟。hTERT在正常細(xì)胞中表達(dá)量很低,而在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量很高,在hTERT轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),提示hTERT啟動(dòng)子不僅具有腫瘤靶向性,并且具有較強(qiáng)的啟動(dòng)活性,可以使基因高表達(dá)。因此,本實(shí)驗(yàn)擬研究受hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的Noxa和Puma基因?qū)Ω伟〩epG2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移與侵襲的影響及其潛在的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探討pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma兩種真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、凋亡、遷移與侵襲的影響及其潛在分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)方法:(1)細(xì)胞增殖分析:兩種重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞24h、48h、72h后,通過以下實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞增殖情況:(1)細(xì)胞形態(tài)觀察:于光學(xué)顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞形態(tài)變化;(2)CCK-8法分析轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞的生存率。(2)細(xì)胞凋亡分析:兩種重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,通過以下實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞凋亡情況:(1)Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)和分析細(xì)胞凋亡率;(2)Annexin V-FITC分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率;(3)Real-time PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax、mcl-1、bcl2A1的mRNA表達(dá)水平;(4)Western-blot分析凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8、cleaved-Caspase9的表達(dá)水平。(3)細(xì)胞遷移與侵襲性分析:兩種重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,通過以下實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞的遷移和侵襲能力:(1)克隆形成實(shí)驗(yàn);(2)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn);(3)Transwell小室實(shí)驗(yàn);(4)Real-time PCR檢測(cè)遷移侵襲相關(guān)基因mmp-9的mRNA表達(dá)水平。(4)兩種重組真核表達(dá)質(zhì)粒的腫瘤細(xì)胞靶向性初步分析:將兩種重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma分別轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞HL7702細(xì)胞后,利用CCK-8法分析兩種細(xì)胞生存率變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)重組質(zhì)粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖。首先于光學(xué)顯微鏡下觀察,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma組與空白組和陰性對(duì)照組相比,呈現(xiàn)出細(xì)胞發(fā)生皺縮、變圓、內(nèi)部顆粒物增多、脫落細(xì)胞數(shù)增多等凋亡細(xì)胞的典型特征,且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加劇。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生存率結(jié)果顯示,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma和pcTERT組相比,細(xì)胞生存率顯著下降,且呈時(shí)間依賴性。轉(zhuǎn)染后72h,兩組細(xì)胞生存率均下降30%左右。同時(shí),在各時(shí)間點(diǎn)pcTERT-Puma組細(xì)胞生存率均略低于pcTERT-Noxa組。(2)重組質(zhì)粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡:(1)Hoechst33258染色后在熒光顯微鏡下觀察,pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma組出現(xiàn)較多的凋亡細(xì)胞。初步計(jì)算細(xì)胞凋亡率,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma組與陰性對(duì)照pc TERT組細(xì)胞凋亡率分別為(31.09±3.87)%、(34.87±3.23)%和(15.92±2.9)%(P0.05);(2)Annexin V-FITC結(jié)果顯示,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞72h后,細(xì)胞凋亡率分別為(29.35±0.64)%和(32.9±0.71)%,顯著高于陰性對(duì)照pcTERT組(18.67±1.21)%(P0.01),且pcTERT-Puma組細(xì)胞凋亡率高于pcTERT-Noxa組;(3)Real-time PCR分析結(jié)果顯示:在轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞72h后,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma組與pcTERT組相比,抗凋亡相關(guān)基因bcl-2、mcl-1、bcl2A1 mRNA表達(dá)水平顯著下降(P0.05),促凋亡基因bax mRNA表達(dá)水平顯著上升(P0.05);(4)蛋白免疫印跡分析結(jié)果顯示:在轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞72h后,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma組與pcTERT組相比,凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著下降(P0.05),Bax、cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8、cleaved-Caspase9的表達(dá)水平顯著上升(P0.05)。(3)重組質(zhì)粒pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma明顯抑制HepG2細(xì)胞的遷移與侵襲:(1)克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,空白組與對(duì)照組形成的細(xì)胞克隆數(shù)與重組質(zhì)粒組相比較多,且單個(gè)克隆大,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma組克隆形成率與pTRET組相比具有顯著性差異;(2)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在制作細(xì)胞傷口模型后,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma組與pcTERT組相比,隨時(shí)間延長(zhǎng)劃痕間距減小趨勢(shì)很弱,并且出現(xiàn)較多的脫落細(xì)胞。且分別在制作細(xì)胞傷口模型24、48、72h后,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma組與pcTERT組相比,劃痕愈合率均具有顯著性差異(P0.05);(3)Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma組附著于下室聚碳酸酯膜的細(xì)胞顯著低于pcTERT組和空白組;(4)Real-time PCR分析結(jié)果顯示:在轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞72h后,pcTERT-Noxa、pcTERT-Puma組與pcTERT組相比,遷移侵襲相關(guān)基因mmp-9的m RNA表達(dá)水平顯著下降(P0.05)。(4)初步研究重組質(zhì)粒對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向性作用。CCK-8檢測(cè)兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染正常肝細(xì)胞HL7702細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞后的細(xì)胞生存率的結(jié)果顯示,HL7702細(xì)胞生存率隨時(shí)間的延長(zhǎng)下降趨勢(shì)不明顯,而HepG2細(xì)胞生存率隨時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì),并且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)HL7702細(xì)胞生存率與HepG2細(xì)胞相比均具有顯著性差異(P0.05)。轉(zhuǎn)染后72h,pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma組HL7702細(xì)胞的生存率僅下降20%左右,而轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞的生存率下降可達(dá)50%左右。提示兩種重組質(zhì)粒對(duì)肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的增殖抑制作用具有差異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:(1)pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma質(zhì)�？烧T導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡,且可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的遷移與侵襲。(2)pcTERT-Noxa和pcTERT-Puma質(zhì)粒對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞HL7702細(xì)胞的增殖抑制作用具有差異性。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7
【圖文】：

Noxa 和 pcTERT-Puma 重組和 XbaI 雙酶切，獲得 966bp h質(zhì)粒片段I 和 XbaI 雙酶切，獲得 582bp性質(zhì)粒片段重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后 HepGTERT-Noxa 和 pcTERT-Pum不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)。壁生長(zhǎng)，形態(tài)飽滿，有折狀態(tài)與空白組相似；pcTE，皺縮、變形、出現(xiàn)較多胞仍長(zhǎng)勢(shì)良好，與 48h 相

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，光鏡下HepG2細(xì)胞形態(tài)（100×）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 高建芝;杜經(jīng)麗;李佳;姬翔;韋立新;;VEGF相關(guān)信號(hào)通路在肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J];臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志;2014年01期

2 謝奇朋;張林杰;張旭東;潘婧婧;;BH3-only蛋白Noxa在依托泊苷誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡中的作用[J];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2009年03期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 馬薇;noxa mRNA及其編碼蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2010年

本文編號(hào)：2726919