【摘要】：松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)傳入我國已有三十多年,由松材線蟲引起的松樹萎蔫病(Pine Wilt Disease,PWD)嚴(yán)重破壞我國森林生態(tài)系統(tǒng),造成了不可估量的損失。至今仍未找到有效防治松材線蟲的方法,松材線蟲新的疫區(qū)仍在不斷增加,且各種證據(jù)表明疫區(qū)有由氣候溫暖的南方逐漸向寒冷的北方擴(kuò)散的趨勢,最北已達(dá)到遼寧省大連市等地。松材線蟲難以防治與其發(fā)病特點(diǎn)相關(guān),病害發(fā)生初期沒有明顯的特征不易被發(fā)現(xiàn),且其病害傳播、病情發(fā)展極為迅速,當(dāng)出現(xiàn)明顯癥狀時疫情已經(jīng)難以控制。松材線蟲在與寄主植物互作過程中,通過產(chǎn)生效應(yīng)因子破壞寄主防御系統(tǒng),并在寄主體內(nèi)快速繁殖蔓延直至寄主死亡。因此,通過對與致病性相關(guān)的松材線蟲效應(yīng)因子進(jìn)行研究,為揭示松材線蟲的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。雖然早已完成基因組測序,但由于寄生策略與其他植物線蟲不同,松材線蟲僅找到少量效應(yīng)因子的同源基因。本試驗(yàn)通過提取接種松樹后回收的松材線蟲總RNA,構(gòu)建了 15個轉(zhuǎn)錄組文庫,對其進(jìn)行測序并分析差異表達(dá)基因,再經(jīng)共表達(dá)及GO富集分析篩選出松材線蟲候選效應(yīng)因子并對其中3條候選效應(yīng)因子基因進(jìn)行功能分析及驗(yàn)證。試驗(yàn)所用線蟲是由東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)系線蟲菌物實(shí)驗(yàn)室提供的松材線蟲蟲株Bx2044和擬松材線蟲蟲株Bm0617,及中國林業(yè)科學(xué)院提供的松材線蟲蟲株Bx1022。為探究這3個線蟲蟲株的致病性強(qiáng)弱,選取黑松(Pinus.thunbrgii)、馬尾松(P.massoniana)及樟子松(P.sylvestris var.mongolic)作為寄主進(jìn)行接種試驗(yàn)。將Bx1022、Bx2044和Bm0617分別接種于黑松、馬尾松及樟子松,計(jì)算感病指數(shù)并對線蟲在寄主體內(nèi)繁殖量進(jìn)行分析。結(jié)果表明其中Bx1022對黑松、馬尾松和樟子松致病性最強(qiáng)且黑松對其最為感病,接種1d與23 d是產(chǎn)生大量的效應(yīng)因子的兩個時間點(diǎn),而黑松和馬尾松對松材線蟲較為感病且互作關(guān)系明顯,因此選取Bx1022接種黑松和馬尾松后1d與23 d這里兩個時間點(diǎn)回收線蟲并提取線蟲總RNA為接種組,以無菌水浸泡2 h的Bx1022的總RNA作為CK組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。通過對接種組和CK組轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá)量比較,從15個轉(zhuǎn)錄組中總共檢測到17747個基因表達(dá),根據(jù)差異顯著表達(dá)分析(t-text,n=3)結(jié)果,其中Pm-Bx1022-1d中有10852個基因差異表達(dá)不顯著,6895個基因差異表達(dá)顯著;Pm-Bx1022-23d中有9522個基因差異表達(dá)不顯著,有8225個基因差異表達(dá)顯著;Pt-Bx1022-1d中有10924個基因基因差異表達(dá)不顯著,有6823個基因差異表達(dá)顯著;Pt-Bx1022-23d中有8273個基因差異表達(dá)不顯著,9474個基因基因差異表達(dá)顯著。經(jīng)共表達(dá)分析結(jié)果顯示共1357個基因在兩種樹種兩個時間點(diǎn)表現(xiàn)出共性,其中606條基因2樹種2個時間點(diǎn)表達(dá)量均顯著上調(diào),751條基因表達(dá)量均顯著下調(diào)。GO富集分析及跨膜結(jié)構(gòu)域分析選取Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9為松材線蟲候選效應(yīng)因子,并進(jìn)行基因克隆及功能分析。為進(jìn)一步驗(yàn)證候選效應(yīng)因子,對Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9進(jìn)行基因克隆后由原位雜交試驗(yàn)及RNAi試驗(yàn)進(jìn)行基因功能分析。原位雜交試驗(yàn)結(jié)果顯示,Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9基因在均在松材線蟲食道腺上表達(dá)。線蟲效應(yīng)因子分泌部位在食道腺、性腺和側(cè)尾腺等器官上,其中食道腺為主要分泌器官,因此原位雜交試驗(yàn)結(jié)果表明該3個候選效應(yīng)因子分泌部位符合線蟲效應(yīng)因子的分泌部位。為進(jìn)一步驗(yàn)證其基因功能進(jìn)行了 RNAi試驗(yàn),結(jié)果表明經(jīng)RNAi處理后的松材線蟲相應(yīng)基因表達(dá)量下調(diào)。將Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9分別沉默后,以正常培養(yǎng)的Bx1022作為試驗(yàn)對照與無菌水作為空白對照,RNAi-Ef1、RNAi-Ef3和RNAi-Ef9為RNAi試驗(yàn)組對黑松進(jìn)行接種試驗(yàn),結(jié)果顯示RNAi試驗(yàn)組黑松出現(xiàn)癥狀時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)晚于試驗(yàn)對照組,甚至在試驗(yàn)對照組已出現(xiàn)死亡的情況下才開始出現(xiàn)癥狀。表明將Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9基因分別單獨(dú)沉默后,均對松材線蟲的致病性產(chǎn)生了影響。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證,Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9基因這3條基因的功能與線蟲致病性相關(guān)。根據(jù)癥狀出現(xiàn)時間與枯萎死亡時間,得出RNAi后對黑松致病性:RNAi-Ef3RNAi-Ef9RNAi-Ef1,表明各基因?qū)�蟲致病性的影響:Bx-Ef1Bx-Ef9Bx-Ef3。通過以上試驗(yàn)結(jié)果證明,Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9基因無論表達(dá)部位還是基因功能都符合線蟲效應(yīng)因子的應(yīng)有特征,因此鑒定這3條基因?yàn)樾?yīng)因子。通過Q-PCR試驗(yàn)檢測Bx1022和Bx2044分別接種黑松、馬尾松和樟子松23 d后Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9基因相應(yīng)的表達(dá)量,試驗(yàn)結(jié)果顯示Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9基因均表現(xiàn)為在Pm-Bx2044-23d和Ps-Bx1022-23d表達(dá)量無明顯變化(-1log21),其余表現(xiàn)為明顯上調(diào)(log21),其中Bx-Ef1表達(dá)量上調(diào)最多。結(jié)果表明這3條基因的表達(dá)量和線蟲的致病性正相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S763.18
【圖文】：

圖２－３黑松接種線蟲后的癥狀圖逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｆｉｇｕｒｅ邋ｓｙｍｐｔｏｍｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ邋ｎｅｍａｔｏｄｅｓ邋ｏｆ邋Ｐ．邋ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ逡逑圖為黑松（Ｐｔ）接種Ｂｘｌ０２２、Ｂｘ２０４４、Ｂｍ０６１７和無菌水（ＣＫ）后Ｉｄ、各松樹出現(xiàn)癥狀時間點(diǎn)（７ｄ、９ｄ、１１逡逑ｄ、１３ｄ邋和邋１５ｄ）和邋２９ｄ逡逑

２線蟲致病性研宄逡逑Ｐｍ－ＣＫ：至觀察結(jié)束，一直處于健康，水分充足狀態(tài)。逡逑分別接種３個線蟲蟲株后，樟子松莖段變化情況（圖２－８）：逡逑Ｐｔ－－Ｂｘｌ０２２：邋１３邋ｄ莖段開始褐變，隨后逐漸變干，變硬；逡逑Ｐｔ－Ｂｍ０６１７：邋ｌｉｄ莖段開始褐變，隨后逐漸變干，變硬；逡逑Ｐｔ－Ｂｘ２０４４：邋１７ｄ莖段開始褐變，隨后逐漸變干，變硬；逡逑Ｐｔ－ＣＫ：至觀察結(jié)束，一直處于健康，水分充足狀態(tài)。逡逑分別接種３個線蟲蟲株后，黑松莖段變化情況（圖２－９）：逡逑Ｐｓ－Ｂｘｌ０２２：邋９ｄ莖段開始褐變，隨后逐漸變干，變硬；逡逑Ｐｓ－Ｂｍ０６１７：邋１５ｄ莖段開始褐變，隨后逐漸變干，變硬；逡逑Ｐｓ－Ｂｘ２０４４：邋１３邋ｄ莖段開始褐變

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2724740