【摘要】：多藥物和有毒化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family,MATE)是生物中5類解毒輸出轉運蛋白家族之一,成員分布廣泛,遍及古細菌、細菌、酵母、動物和植物。目前,研究發(fā)現的植物中MATE型轉運蛋白的轉運底物有煙堿、原花青素、花青素、檸檬酸鹽、脫落酸等,主要功能為次生代謝物的積累、重金屬轉運和激素信號轉導等。原花青素(proanthocyanidins,PAs),也叫縮合單寧,是植物酚類物質中普遍存在的組分之一,呈現出多樣的生物和生物化學活性,并對人體健康有潛在的有益作用。蕎麥(Fagopyrum esculentum)屬于蓼科蕎麥屬植物,是一種具有很高食用價值和醫(yī)療保健作用的經濟作物,也是一種極具開發(fā)潛力的功能性食品原料。蕎麥有兩個常用栽培種:甜蕎麥和苦蕎麥。世界上其他國家栽培的蕎麥大部分都為甜蕎,中國是世界上唯一大面積栽培苦蕎的國家,面積和產量均居世界第一�？嗍w由于比甜蕎含有更多的黃酮類化合物而備受關注。前期蕎麥種子轉錄組測序結果顯示,MATE注釋的unigene共有54條,但對這些基因的研究報道極少,只有LEI等在蕎麥中發(fā)現2個MATE基因,并通過對其編碼蛋白--FeMATE1和FeMATE2的功能分析,得出兩者與蕎麥解除Al離子脅迫相關。基于以上報道,本研究(1)采用RACE克隆技術獲得2條(Fett12和Femate3)蕎麥MATE基因的全長cDNA,并對其進行生物信息學分析;(2)完成了蕎麥Fett12基因的克隆、測序,及其在甜蕎和苦蕎不同部位和種子不同發(fā)育階段的表達模式;(3)運用分光光度法和HPLC法測定了甜蕎與苦蕎不同發(fā)育階段花和種子中的原花青素、蘆丁和兒茶素含量;(4)構建FeTT12真核表達載體,研究其在煙草中的亞細胞定位。主要結果如下:提取蕎麥RNA,RACE克隆,獲得了2條MATE全長cDNA序列。通過ExPASy中的protparam在線分析和構建系統進化樹得知,其中1條編碼一個含有492個氨基酸殘基的蛋白,其分子量為53.81 kD,等電點為6.75,屬于原花青素MATE轉運蛋白,將其命名為Fett12(GenBankAccession No.MG515589)。將FeTT12氨基酸序列與其他植物TT12的氨基酸序列進行比對和同源分析,結果表明,FeTT12與MnTT12同源性最高,為77.3%;與擬南芥TT12同源性最低,為41.5%。另一條編碼一個含有516個氨基酸殘基的蛋白,分子量為56.12 kD,等電點為6.52,屬于檸檬酸鹽MATE轉運蛋白,將其與之前報道的蕎麥FeMATE2蛋白和其他物種中轉運檸檬酸鹽的MATE蛋白進行多序列比對及同源分析,發(fā)現其與Al離子脅迫相關的蕎麥MATE蛋白FeMATE2的同源性達到96.33%;與其他檸檬酸鹽轉運MATE蛋白的同源性也在59%以上;因此,將其命名為Femate3(GenBankAccession No.MG515590)。Fett12基因克隆、測序結果表明:該基因的編碼區(qū)全長2396 bp,由8個外顯子、7個內含子組成,內含子的剪切方式均符合GT-AG剪切規(guī)律。通過與擬南芥和蒺藜苜蓿tt12的基因進行比較,得到它們的內含子外顯子數量一致。熒光定量-PCR結果表明:Fett12基因的表達具有明顯的時空特異性,且在蕎麥葉片中的表達量最高。在甜蕎與苦蕎種子的不同發(fā)育階段,Fett12的表達模式亦有差異,伴隨著種子不斷發(fā)育成熟,Fett12基因在苦蕎種子中的表達模式呈現先升高后降低的趨勢,在甜蕎種子中的表達模式為逐漸升高。蕎麥中,原花青素、蘆丁和兒茶素作為次級代謝產物,其分布具有明顯的組織器官差異。對于甜蕎,原花青素在花中的含量最高;對于苦蕎,原花青素在發(fā)育初期的種子中含量最高;蘆丁和兒茶素均是花中含量高于種子。成熟期種子中,三種化合物在苦蕎中的含量均高于甜蕎,且基本都是在灌漿期(21DPA)與甜蕎拉開差距。其中成熟期種子中,苦蕎蘆丁的含量是甜蕎的16倍,原花青素的含量是甜蕎的3倍。在甜蕎花苞、花及種子不同發(fā)育階段,三種化合物的含量均在花中最高。煙草亞細胞定位:成功構建了蕎麥FeTT12的真核表達載體,激光共聚焦觀察到FeTT12定位于膜上。本研究通過分析蕎麥MATE基因的克隆與表達為MATE型轉運蛋白成員在蕎麥中的功能研究提供基礎。
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S517;Q943.2
【圖文】：

內外的化學物質以及信號交換。根據轉運能量的來源不同，可以將轉運蛋白分為初級轉運蛋白和次級轉運蛋白。初級轉運蛋白的能量來源主要為 ATP 水解、光子吸收、電子流、底物脫羧或甲基轉移反應等過程釋放的能量[1-2]，典型代表為 ATP 結合盒（ATP binding cassette,ABC）超家族；而次級轉運蛋白的能量來源則是利用物質在膜內外濃度不同造成的電化學滲透勢能來轉運底物[3-4]，典型代表為多藥物和有毒化合物外排家族（multidrug and toxic compound extrusion family，MATE）。1.1.2 MATE 基因家族概述MATE 蛋白作為生物中 5 類解毒輸出轉運蛋白家族之一，成員分布廣泛，遍及古細菌、細菌、酵母、動物和植物[5]。通過已知的 MATE 轉運蛋白系統發(fā)育研究（圖1.1），MATE 家族存在 3 個大簇和 14 個小簇[6-8]：第 1 簇為細菌多藥外排蛋白；第2 簇由真核生物組成，來源于真菌、植物、動物、原生動物等；第 3 簇為存在于細菌和原始細菌中的 MATE 轉運蛋白。所有的 MATE 轉運蛋白雖沒有明顯的共有保守序列，但多數成員之間都具有大約 40%的序列相似性。

圖 1.2 植物中 MATE 基因表達的組織特異性和生理作用圖[20]Fig 1.2 Expression and Physiological of MATE Gene in Plants[20]1.2 黃酮類化合物1.2.1 黃酮類化合物概述黃酮類化合物在結構上有共同的三環(huán)化學結構（C6-C3-C6），屬于多酚類物質，主要類別有黃酮、花青素、黃酮醇、黃烷醇和原花青素或縮合單寧[26]。作為次級代謝產物，這些化合物的含量和分布根據植物種類、器官、發(fā)育階段和生長條件的不同而具有明顯差異[27]。黃酮類化合物在植物中具有廣泛的作用，如抗氧化活性，紫外線保護和防御植物病原體（例如，在豆類植物中起植物抗毒素作用的異黃酮），豆科植物結瘤，雄性能育，視覺信號和生長素運輸控制等[28]。1.2.2 原花青素原花青素（Proanthocyanidins，PAs），也稱為縮合單寧，是一組天然存在于多

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 于一帆;朱小彬;葛會敏;陳云;;基于綠色熒光蛋白瞬時表達的植物亞細胞定位方法[J];江蘇農業(yè)科學;2014年12期

2 孫林峰;王佳偉;顏寧;;MFS超家族轉運蛋白結構與分子機制的研究[J];生命科學;2011年11期

本文編號：2724675