【摘要】：多藥物和有毒化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family,MATE)是生物中5類(lèi)解毒輸出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族之一,成員分布廣泛,遍及古細(xì)菌、細(xì)菌、酵母、動(dòng)物和植物。目前,研究發(fā)現(xiàn)的植物中MATE型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)底物有煙堿、原花青素、花青素、檸檬酸鹽、脫落酸等,主要功能為次生代謝物的積累、重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。原花青素(proanthocyanidins,PAs),也叫縮合單寧,是植物酚類(lèi)物質(zhì)中普遍存在的組分之一,呈現(xiàn)出多樣的生物和生物化學(xué)活性,并對(duì)人體健康有潛在的有益作用。蕎麥(Fagopyrum esculentum)屬于蓼科蕎麥屬植物,是一種具有很高食用價(jià)值和醫(yī)療保健作用的經(jīng)濟(jì)作物,也是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的功能性食品原料。蕎麥有兩個(gè)常用栽培種:甜蕎麥和苦蕎麥。世界上其他國(guó)家栽培的蕎麥大部分都為甜蕎,中國(guó)是世界上唯一大面積栽培苦蕎的國(guó)家,面積和產(chǎn)量均居世界第一�？嗍w由于比甜蕎含有更多的黃酮類(lèi)化合物而備受關(guān)注。前期蕎麥種子轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示,MATE注釋的unigene共有54條,但對(duì)這些基因的研究報(bào)道極少,只有LEI等在蕎麥中發(fā)現(xiàn)2個(gè)MATE基因,并通過(guò)對(duì)其編碼蛋白--FeMATE1和FeMATE2的功能分析,得出兩者與蕎麥解除Al離子脅迫相關(guān)�；谝陨蠄�(bào)道,本研究(1)采用RACE克隆技術(shù)獲得2條(Fett12和Femate3)蕎麥MATE基因的全長(zhǎng)cDNA,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;(2)完成了蕎麥Fett12基因的克隆、測(cè)序,及其在甜蕎和苦蕎不同部位和種子不同發(fā)育階段的表達(dá)模式;(3)運(yùn)用分光光度法和HPLC法測(cè)定了甜蕎與苦蕎不同發(fā)育階段花和種子中的原花青素、蘆丁和兒茶素含量;(4)構(gòu)建FeTT12真核表達(dá)載體,研究其在煙草中的亞細(xì)胞定位。主要結(jié)果如下:提取蕎麥RNA,RACE克隆,獲得了2條MATE全長(zhǎng)cDNA序列。通過(guò)ExPASy中的protparam在線分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)得知,其中1條編碼一個(gè)含有492個(gè)氨基酸殘基的蛋白,其分子量為53.81 kD,等電點(diǎn)為6.75,屬于原花青素MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,將其命名為Fett12(GenBankAccession No.MG515589)。將FeTT12氨基酸序列與其他植物TT12的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和同源分析,結(jié)果表明,FeTT12與MnTT12同源性最高,為77.3%;與擬南芥TT12同源性最低,為41.5%。另一條編碼一個(gè)含有516個(gè)氨基酸殘基的蛋白,分子量為56.12 kD,等電點(diǎn)為6.52,屬于檸檬酸鹽MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,將其與之前報(bào)道的蕎麥FeMATE2蛋白和其他物種中轉(zhuǎn)運(yùn)檸檬酸鹽的MATE蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)及同源分析,發(fā)現(xiàn)其與Al離子脅迫相關(guān)的蕎麥MATE蛋白FeMATE2的同源性達(dá)到96.33%;與其他檸檬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)MATE蛋白的同源性也在59%以上;因此,將其命名為Femate3(GenBankAccession No.MG515590)。Fett12基因克隆、測(cè)序結(jié)果表明:該基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)2396 bp,由8個(gè)外顯子、7個(gè)內(nèi)含子組成,內(nèi)含子的剪切方式均符合GT-AG剪切規(guī)律。通過(guò)與擬南芥和蒺藜苜蓿tt12的基因進(jìn)行比較,得到它們的內(nèi)含子外顯子數(shù)量一致。熒光定量-PCR結(jié)果表明:Fett12基因的表達(dá)具有明顯的時(shí)空特異性,且在蕎麥葉片中的表達(dá)量最高。在甜蕎與苦蕎種子的不同發(fā)育階段,Fett12的表達(dá)模式亦有差異,伴隨著種子不斷發(fā)育成熟,Fett12基因在苦蕎種子中的表達(dá)模式呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在甜蕎種子中的表達(dá)模式為逐漸升高。蕎麥中,原花青素、蘆丁和兒茶素作為次級(jí)代謝產(chǎn)物,其分布具有明顯的組織器官差異。對(duì)于甜蕎,原花青素在花中的含量最高;對(duì)于苦蕎,原花青素在發(fā)育初期的種子中含量最高;蘆丁和兒茶素均是花中含量高于種子。成熟期種子中,三種化合物在苦蕎中的含量均高于甜蕎,且基本都是在灌漿期(21DPA)與甜蕎拉開(kāi)差距。其中成熟期種子中,苦蕎蘆丁的含量是甜蕎的16倍,原花青素的含量是甜蕎的3倍。在甜蕎花苞、花及種子不同發(fā)育階段,三種化合物的含量均在花中最高。煙草亞細(xì)胞定位:成功構(gòu)建了蕎麥FeTT12的真核表達(dá)載體,激光共聚焦觀察到FeTT12定位于膜上。本研究通過(guò)分析蕎麥MATE基因的克隆與表達(dá)為MATE型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員在蕎麥中的功能研究提供基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S517;Q943.2
【圖文】：

內(nèi)外的化學(xué)物質(zhì)以及信號(hào)交換。根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)能量的來(lái)源不同，可以將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為初級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。初級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的能量來(lái)源主要為 ATP 水解、光子吸收、電子流、底物脫羧或甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)等過(guò)程釋放的能量[1-2]，典型代表為 ATP 結(jié)合盒（ATP binding cassette,ABC）超家族；而次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的能量來(lái)源則是利用物質(zhì)在膜內(nèi)外濃度不同造成的電化學(xué)滲透勢(shì)能來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)底物[3-4]，典型代表為多藥物和有毒化合物外排家族（multidrug and toxic compound extrusion family，MATE）。1.1.2 MATE 基因家族概述MATE 蛋白作為生物中 5 類(lèi)解毒輸出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族之一，成員分布廣泛，遍及古細(xì)菌、細(xì)菌、酵母、動(dòng)物和植物[5]。通過(guò)已知的 MATE 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)發(fā)育研究（圖1.1），MATE 家族存在 3 個(gè)大簇和 14 個(gè)小簇[6-8]：第 1 簇為細(xì)菌多藥外排蛋白；第2 簇由真核生物組成，來(lái)源于真菌、植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物等；第 3 簇為存在于細(xì)菌和原始細(xì)菌中的 MATE 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。所有的 MATE 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白雖沒(méi)有明顯的共有保守序列，但多數(shù)成員之間都具有大約 40%的序列相似性。

圖 1.2 植物中 MATE 基因表達(dá)的組織特異性和生理作用圖[20]Fig 1.2 Expression and Physiological of MATE Gene in Plants[20]1.2 黃酮類(lèi)化合物1.2.1 黃酮類(lèi)化合物概述黃酮類(lèi)化合物在結(jié)構(gòu)上有共同的三環(huán)化學(xué)結(jié)構(gòu)（C6-C3-C6），屬于多酚類(lèi)物質(zhì)，主要類(lèi)別有黃酮、花青素、黃酮醇、黃烷醇和原花青素或縮合單寧[26]。作為次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些化合物的含量和分布根據(jù)植物種類(lèi)、器官、發(fā)育階段和生長(zhǎng)條件的不同而具有明顯差異[27]。黃酮類(lèi)化合物在植物中具有廣泛的作用，如抗氧化活性，紫外線保護(hù)和防御植物病原體（例如，在豆類(lèi)植物中起植物抗毒素作用的異黃酮），豆科植物結(jié)瘤，雄性能育，視覺(jué)信號(hào)和生長(zhǎng)素運(yùn)輸控制等[28]。1.2.2 原花青素原花青素（Proanthocyanidins，PAs），也稱(chēng)為縮合單寧，是一組天然存在于多

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 于一帆;朱小彬;葛會(huì)敏;陳云;;基于綠色熒光蛋白瞬時(shí)表達(dá)的植物亞細(xì)胞定位方法[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年12期

2 孫林峰;王佳偉;顏寧;;MFS超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)與分子機(jī)制的研究[J];生命科學(xué);2011年11期

本文編號(hào)：2724675