【摘要】：第一部分miR-1250及其宿主基因AATK在食管鱗狀細(xì)胞癌中的作用及其甲基化狀態(tài)目的:研究miR-1250和細(xì)胞凋亡關(guān)聯(lián)酪氨酸激酶(apoptosis-associated tyrosine kinase,AATK)在食管癌細(xì)胞系及食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)組織中的表達(dá)情況及甲基化狀態(tài),并分析其表達(dá)和甲基化狀態(tài)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。探討mi R-1250及其宿主基因AATK在ESCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法:1應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄多聚核苷酸酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)的方法分別檢測miR-1250和AATK的mRNA在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-d C處理前后的食管癌細(xì)胞系以及ESCC組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)情況。2應(yīng)用免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot,WB)檢測在5-Aza-dC處理前后的食管癌細(xì)胞系中AATK蛋白的表達(dá)情況。3應(yīng)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)SP法檢測ESCC組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中AATK蛋白的表達(dá)情況。4應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Methylation specific polymerase chain reaction,MSP)的方法分別檢測AATK在5-Aza-dC處理前后的食管癌細(xì)胞系以及ESCC組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中的甲基化狀態(tài)。結(jié)果:1.mi R-1250和AATK在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及甲基化狀態(tài):mi R-1250和AATK在5-Aza-dC處理后的4株食管癌細(xì)胞系(Eca109、TE1、Yes-2、T.TN)中的表達(dá)均顯著上調(diào);AATK在5-Aza-dC處理后的4株食管癌細(xì)胞系中甲基化程度均明顯降低(P0.05)。2.mi R-1250和AATK的mRNA在ESCC組織中的表達(dá)情況:mi R-1250和AATK在ESCC組織中的相對表達(dá)量顯著低于其相應(yīng)癌旁正常組織(P0.05),并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和TNM分期相關(guān)(P均0.05),與性別、年齡無關(guān)(P均0.05)。3.AATK蛋白在ESCC組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)情況:AATK蛋白在ESCC組織中的表達(dá)陽性率顯著低于其相應(yīng)癌旁正常組織(P0.05),并且與分化程度和TNM分期相關(guān)(P均0.05),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、性別和年齡無關(guān)(P均0.05)。4.AATK在ESCC組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中的甲基化狀態(tài):AATK在ESCC組織中的甲基化率顯著高于其相應(yīng)癌旁正常組織(P0.05),并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和TNM分期相關(guān)(P均0.05),與性別、年齡無關(guān)(P均0.05)。5.mi R-1250、AATK的表達(dá)與甲基化間的相關(guān)性分析:1)在ESCC組織中mi R-1250和AATK的mRNA表達(dá)之間呈明顯正相關(guān)(P0.05)。2)AATK的mRNA表達(dá)在其蛋白表達(dá)陽性的ESCC組織中顯著高于其蛋白表達(dá)陰性的ESCC組織(P0.05)。3)miR-1250在發(fā)生甲基化的ESCC組織中的表達(dá)明顯低于未發(fā)生甲基化的ESCC組織(P0.05)。4)AATK在發(fā)生甲基化的ESCC組織中的mRNA表達(dá)顯著低于未發(fā)生甲基化的ESCC組織(P0.05)。5)AATK蛋白在發(fā)生甲基化的ESC組織中的表達(dá)顯著低于未發(fā)生甲基化的ESCC組織(P0.05)。第二部分miR-1250在食管癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能目的:研究過表達(dá)mi R-1250后,食管癌細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力的改變。方法:1在Eca109細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-1250的mimics,并通過qRT-PCR的方法檢測轉(zhuǎn)染效率。2應(yīng)用MTS、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-1250后對食管癌細(xì)胞增殖能力的影響。3應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-1250后對食管癌細(xì)胞遷移能力的影響。4應(yīng)用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-1250后對食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果:1.在Eca109細(xì)胞中過表達(dá)miR-1250后的轉(zhuǎn)染情況:在Eca109細(xì)胞中成功過表達(dá)mi R-1250,miR-1250在轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中表達(dá)均顯著高于對照組的Eca109細(xì)胞(P0.05)。2.過表達(dá)miR-1250后對食管癌細(xì)胞增殖能力的影響:MTS和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)mi R-1250能夠顯著抑制Eca109細(xì)胞的增殖活性(P0.05)。3.過表達(dá)miR-1250后對食管癌細(xì)胞遷移能力的影響:劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-1250能夠顯著抑制Eca109細(xì)胞的遷移能力(P0.05)。4.過表達(dá)miR-1250后對食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響:Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)mi R-1250能夠顯著抑制Eca109細(xì)胞的侵襲能力(P0.05)。結(jié)論:1.食管鱗癌中miR-1250與其宿主基因AATK的表達(dá)具有一致性,且它們的表達(dá)降低與食管鱗癌患者的分化程度和TNM分期密切相關(guān),提示AATK可能是miR-1250的宿主基因,并且兩者在食管鱗癌中可能作為抑癌基因,且它們的失活與食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。2.啟動子區(qū)異常高甲基化可能是miR-1250及AATK在食管鱗癌中表達(dá)沉默的重要機(jī)制之一。3.過表達(dá)miR-1250后食管癌細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力受到抑制,進(jìn)一步提示mi R-1250與食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1
【圖文】：

圖 1AATK 基因 CpG 島分布及 MSP 引物位置Fig.1 CpG islands distribution ofAATK and location of MSP pri: Blue region: Position of CpG islands (-524~-293,-265~254); →←ion of MSP primer; +1: Transcription initiation site圖 2 食管正常組織與鱗癌組織 HE 染色（200×）

研 究 論 文附 圖圖 1AATK 基因 CpG 島分布及 MSP 引物位置Fig.1 CpG islands distribution ofAATK and location of MSP primerNote: Blue region: Position of CpG islands (-524~-293,-265~254); →←: Thelocation of MSP primer; +1: Transcription initiation site

【參考文獻(xiàn)】

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1 羅君;凌志強(qiáng);彭兵鋒;袁嘉敏;鄭智國;毛偉敏;;MicroRNA-31在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系[J];中國癌癥雜志;2013年07期

2 姚莉;孫艷;查何;彭惠民;;miRNA-451表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及對人A549肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡的影響[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年10期

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本文編號：2725605