【摘要】：遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellaa tarda),是一種在淡水和海水魚(yú)類(lèi)中常見(jiàn)的致病菌,同時(shí)也是一種重要的人畜共患病病原菌。本課題組已率先完成了遲緩愛(ài)德華氏菌全基因組測(cè)序和比較基因組研究,然而對(duì)該菌大部分的編碼基因功能仍然不清楚。本課題使用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變文庫(kù)和蛋白質(zhì)組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)方法對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌的功能基因組進(jìn)行初步解析。首先,本課題利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入基因組,對(duì)基因或基因間區(qū)域進(jìn)行失活并建立突變體文庫(kù)。本課題使用編碼martner轉(zhuǎn)座子的pMar2XT7質(zhì)粒為出發(fā)質(zhì)粒,將其改造成為包含綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白和卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)座子pMKGR,對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌EIB202株進(jìn)行大規(guī)模突變株文庫(kù)的構(gòu)建。總共獲得了 20325株突變株,并利用半任意PCR方法,測(cè)定了每個(gè)突變株的插入位點(diǎn)。文庫(kù)中的突變株覆蓋了 2776個(gè)基因,占所有預(yù)測(cè)基因總數(shù)中的77%。本文庫(kù)是遲緩愛(ài)德華氏菌屬和魚(yú)類(lèi)病原菌的第一個(gè)位點(diǎn)確定的大規(guī)模插入失活突變株文庫(kù),可用于系統(tǒng)性地篩選不同條件下必需基因,以及基于熒光報(bào)告基因?qū)υ摼幕虮磉_(dá)調(diào)控進(jìn)行研究。第二方面,本課題使用轉(zhuǎn)座子插入測(cè)序技術(shù)(Transposon insertion sequencing，TIS)系統(tǒng)分析該菌各種條件下的條件必需基因。TIS技術(shù)將轉(zhuǎn)座子大規(guī)模隨機(jī)突變文庫(kù)與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合,用以精確測(cè)定突變株的插入位點(diǎn)和數(shù)量,由此可以追蹤并篩選細(xì)菌在不同條件下的必需基因集合。本研究使用mariner轉(zhuǎn)座子pMar2XT7,構(gòu)建了一個(gè)含有約30萬(wàn)個(gè)單菌落(CFU)的插入失活隨機(jī)突變株文庫(kù)。在此基礎(chǔ)上利用統(tǒng)計(jì)和模擬的方法進(jìn)行必需基因分析,確定遲緩愛(ài)德華氏菌在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基LB條件下生長(zhǎng)所必需的498個(gè)基因,約占總基因數(shù)量的13.8%。接著本課題將突變株文庫(kù)在體外條件下進(jìn)行篩選,包括實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件(即細(xì)菌培養(yǎng)基LB連續(xù)培養(yǎng))篩選得到221個(gè)必需基因;模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的DMEM培養(yǎng)條件下,篩選得到180個(gè)必需基因;用取自養(yǎng)殖場(chǎng)的天然海水在16℃和28℃條件下分別篩選得到82個(gè)和130個(gè)必需基因;利用J774.1巨噬細(xì)胞細(xì)胞模型,篩選得到86個(gè)必需基因。本課題進(jìn)一步將突變株文庫(kù)在魚(yú)體內(nèi)條件下進(jìn)行篩選,使用遲緩愛(ài)德華氏菌EIB202的天然宿主一大菱鲆(Scophthalmus maxiimus L.)作為感染對(duì)象。以大菱鲆宿主的肝臟為感染模型，篩選鑒定得到遲緩愛(ài)德華氏菌感染肝臟必需的228個(gè)基因/基因間區(qū)域。其中包含已報(bào)道的重要的毒力相關(guān)基因,如三型分泌系統(tǒng)(T3SS)和六型分泌系統(tǒng)(T6SS),同時(shí)得到大量未報(bào)道的與感染和致病過(guò)程相關(guān)的基因,并對(duì)它們進(jìn)行了功能分類(lèi)和體內(nèi)感染過(guò)程功能驗(yàn)證。相較于傳統(tǒng)的TIS中單純比較原始和篩選后文庫(kù)的二元比較,本課題進(jìn)一步將TIS拓展到感染過(guò)程時(shí)間序列分析,即在病原菌感染中最關(guān)鍵的14天中,分別在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣,考察該菌從侵染到爆發(fā)整個(gè)過(guò)程中必需基因的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。建立了一種突變株體內(nèi)生存必需性的模式分析的方法(Pattern analysis of conditional essential loci,PACE),獲得了全基因組范圍各基因?qū)υ摼w內(nèi)存活能力貢獻(xiàn)和影響的體內(nèi)動(dòng)態(tài)曲線,并對(duì)所有基因位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)曲線進(jìn)行了聚類(lèi)分析。其中最重要的一類(lèi)為“緩慢清除”曲線(Mitifits),這一類(lèi)曲線包含了主要的毒力基因(T3SS和T6SS)。并由此揭示T3SS/T6SS突變株能夠在體內(nèi)定植和存活一定的時(shí)間,但無(wú)法像野生型那樣進(jìn)一步爆發(fā)致病的特征。進(jìn)一步利用各基因的動(dòng)態(tài)曲線,找到了減毒活疫苗靶點(diǎn)基因的“先存活后清除”動(dòng)態(tài)特征,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行啟發(fā)式搜索,得到89個(gè)候選減毒活疫苗靶點(diǎn)。選擇其中5個(gè)候選基因(分別編碼葉酸代謝基因pabA，pabB;肽聚糖合成途徑中的ETAE 2260;前噬菌體調(diào)控基因ETAE_1614;以及保守的假定蛋白ETAE_0023)構(gòu)建了缺失突變株,進(jìn)行體內(nèi)存活能力驗(yàn)證和免疫保護(hù)臨床試驗(yàn)。結(jié)果表明它們的突變株在體內(nèi)生存過(guò)程符合緩慢清除的特征,均可以激發(fā)宿主的免疫反應(yīng),野生株攻毒后的免疫保護(hù)力(RPS)大于60%,其中pab和ETAE_2260突變株的免疫保護(hù)力高于已知的減毒活疫苗株WED。最后,為掌握遲緩愛(ài)德華氏菌基因組中3599個(gè)蛋白編碼基因之間相互作用關(guān)系,本研究使用生物信息學(xué)方法構(gòu)建了蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。首先,使用Interlog和DDI方法,提取蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)與遲緩愛(ài)德華氏菌進(jìn)行同源比對(duì),基于相關(guān)性互作的原理,構(gòu)建蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),共計(jì)獲得139041對(duì)蛋白與蛋白相互作用(包含2514個(gè)蛋白),繪制了第一個(gè)遲緩愛(ài)德華氏菌的多維度分析的蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。同時(shí),對(duì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,獲得網(wǎng)絡(luò)的模型。進(jìn)一步將蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的樞紐蛋白進(jìn)行分析,建立抗原-蛋白相互作用模型,篩選到了 15個(gè)新的抗原蛋白,為將來(lái)研究新型的亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q78
【圖文】：

２００７邐２００８邐２００９邐２０１０邐２０１１邐２０１２邐２０１３邐２０１４邐２０１５邐２０１６逡逑ＹＥＡＲ逡逑圖１．３邋ＧＯＬＤ數(shù)據(jù)庫(kù)中所有的基因組數(shù)量（以年份和狀態(tài)分類(lèi)）逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｇｅｎｏｍｅ邋ｔｏｔａｌｓ邋ｉｎ邋ＧＯＬＤ邋（ｂｙ邋ｙｅａｒ邋ａｎｄ邋ｓｔａｔｕｓ）１＇逡逑在基因組學(xué)飛速發(fā)展的同時(shí)，功能基因組學(xué)的概念也隨之提出。功能基因組學(xué)的逡逑研究目的是利用基因組測(cè)序所獲得的大量數(shù)據(jù)，來(lái)進(jìn)一步解釋基因和蛋白的功能和相逡逑互作用關(guān)系。功能基因組學(xué)關(guān)注生物動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，例如轉(zhuǎn)錄，翻譯，蛋白與蛋白逡逑相互作用，這擴(kuò)展了靜態(tài)的基因信息，如ＤＮＡ序列和結(jié)構(gòu)。功能基因組學(xué)的目標(biāo)是闡逡逑釋基因組中的ＤＮＡ，轉(zhuǎn)錄后的ＲＮＡ和翻譯后的蛋白質(zhì)這幾個(gè)層次中所發(fā)揮的功能。相逡逑較于傳統(tǒng)的單個(gè)基因研宄，功能基因組學(xué)的重要特征是宏觀地通過(guò)全基因組，應(yīng)用高逡逑

邐２０１５逡逑ＹＥＡＲ逡逑圖１．２完整基因組和基因組草圖數(shù)量（ＧＯＬＤ數(shù)據(jù)庫(kù)，以年份和狀態(tài)分類(lèi)）逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋ａｎｄ邋Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ邋Ｄｒａｆｔ邋Ｇｅｎｏｍｅ邋Ｔｏｔａｌｓ邋ｉｎ邋ＧＯＬＤ邋（ｂｙ邋ｙｅａｒ邋ａｎｄ邋ｓｔａｔｕｓ）［１３］．逡逑Ｇｅｎｏｍｅ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋Ｐｒｏｊｅｃｔｓ逡逑１６＊０００邐—邋Ｃｏｍｐｌｅｔｅ逡逑邐Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ逡逑ｉ：．邋Ａ＼逡逑２００７邐２００８邐２００９邐２０１０邐２０１１邐２０１２邐２０１３邐２０１４邐２０１５邐２０１６逡逑ＹＥＡＲ逡逑圖１．３邋ＧＯＬＤ數(shù)據(jù)庫(kù)中所有的基因組數(shù)量（以年份和狀態(tài)分類(lèi)）逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｇｅｎｏｍｅ邋ｔｏｔａｌｓ邋ｉｎ邋ＧＯＬＤ邋（ｂｙ邋ｙｅａｒ邋ａｎｄ邋ｓｔａｔｕｓ）１＇逡逑在基因組學(xué)飛速發(fā)展的同時(shí)，功能基因組學(xué)的概念也隨之提出。功能基因組學(xué)的逡逑研究目的是利用基因組測(cè)序所獲得的大量數(shù)據(jù)，來(lái)進(jìn)一步解釋基因和蛋白的功能和相逡逑互作用關(guān)系。功能基因組學(xué)關(guān)注生物動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，例如轉(zhuǎn)錄，翻譯，蛋白與蛋白逡逑相互作用，這擴(kuò)展了靜態(tài)的基因信息，如ＤＮＡ序列和結(jié)構(gòu)。功能基因組學(xué)的目標(biāo)是闡逡逑釋基因組中的ＤＮＡ，轉(zhuǎn)錄后的ＲＮＡ和翻譯后的蛋白質(zhì)這幾個(gè)層次中所發(fā)揮的功能。相逡逑較于傳統(tǒng)的單個(gè)基因研宄，功能基因組學(xué)的重要特征是宏觀地通過(guò)全基因組，應(yīng)用高逡逑

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本文編號(hào)：2721431