【摘要】：雙功能酸性脲酶是一種能水解尿素和氨基甲酸乙酯(EC)的多功能酶,EC是一種潛在致癌物,尿素為其前體物;本論文成功將酸性脲酶在大腸桿菌中表達,通過對復性條件的探索及優(yōu)化,復性了在E.coli BL21(DE3)中表達形成包涵體的重組酸性脲酶,并優(yōu)化了復性后脲酶的固定化條件,分析了固定化酶的酶學特性,初步研究了具備EC降解酶功效的固定化酸性脲酶在黃酒中的應用。首先提取了P.rettgeri JN-B815的基因組,設計引物P1、P2從基因組中擴增酸性脲酶全基因組,成功構建了重組質(zhì)粒pET-42a-ureABCEFGD,將重組質(zhì)粒導入E.coli BL21(DE3)中表達,當IPTG濃度在0.4 mmol·L~(-1)時,脲酶酶活達到0.4 U·m L~(-1),EC降解酶酶活達到0.13 U·m L~(-1)。構建了重組質(zhì)粒pCold-ureABCEFGD在E.coli BL21(DE3)表達,對形成的包涵體兩次清洗,蛋白回收率達到53±3%,優(yōu)化了包涵體溶解條件,在含有8 mol·L~(-1)urea、0.05 mmol·L~(-1) DTT、0.05 mol·L~(-1)Arg的緩沖液中(pH8.0)溶解8 h,蛋白質(zhì)回收率達到95±3%。對溶解的包涵體復性,在稀釋復性中,在GSSG/GSH(氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽)=10/1、精氨酸1.5%(w/v)、20%甘油(v/v)復性液中稀釋16倍,復性效果達到最好;在梯度透析復性中,在35倍的稀釋復性液中透析復性總時48 h左右時,復性效果最佳;基于稀釋復性的稀釋-超濾復性,在2000 rpm·時,酶活達到最高。所得脲酶過鎳柱純化,稀釋復性的脲酶和EC降解酶酶活8.1±0.8 U·mg~(-1)、2.7±0.3 U·mg~(-1);梯度透析的脲酶和EC降解酶酶活為10.8±1 U·mg~(-1)、3.4±0.3 U·mg~(-1);超濾-稀釋的脲酶和EC降解酶酶活12.3±1 U·mg~(-1)、3.8±0.5 U·mg~(-1),三種方法復性的蛋白質(zhì)回收率分別為24±5%、22±4%、21±4%。氧化石墨烯(GO)和殼聚糖(CS)復合微球固定化酸性脲酶,并對主要條件進行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在GO和CS的質(zhì)量比為3/2時,兩者結合時間為8 h,戊二醛濃度為2.5%,交聯(lián)8 h后,酶活力回收率可以達到74%。該固定化脲酶在65℃的半衰期為400 min,在20%乙醇濃度以下可保持80%的酶活;在重復使用10次后對底物尿素和EC的催化能力依然保持90%以上。固定化脲酶的Km為9.15 mmol·L~(-1)(尿素),383.86 mmol·L~(-1)(EC),Vmax為1.08μmol·min~(-1)(尿素),0.78μmol·min~(-1)(EC)�？疾旃潭ɑ嵝噪迕冈诹骰卜磻髦刑幚睃S酒時的應用效果,在加酶量為20 U,流速為0.4 m L·min~(-1)時反復處理4次后,50 mL黃酒的尿素的去除率可以達到93.85%,EC的去除率可以達到57.46%。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q814
【圖文】：

目的基因的擴增圖

M：DL10000 Marker; 1：PCR 產(chǎn)物圖 3-1 目的基因的擴增圖Fig.3-1 PCR amplification of ureABCDEFG組擴增的基因大小在 5.4 kb 左右，大小符合目的基因的（5437 bp）。酶重組質(zhì)粒的構建

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本文編號：2718958