【摘要】：雙功能酸性脲酶是一種能水解尿素和氨基甲酸乙酯(EC)的多功能酶,EC是一種潛在致癌物,尿素為其前體物;本論文成功將酸性脲酶在大腸桿菌中表達(dá),通過(guò)對(duì)復(fù)性條件的探索及優(yōu)化,復(fù)性了在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)形成包涵體的重組酸性脲酶,并優(yōu)化了復(fù)性后脲酶的固定化條件,分析了固定化酶的酶學(xué)特性,初步研究了具備EC降解酶功效的固定化酸性脲酶在黃酒中的應(yīng)用。首先提取了P.rettgeri JN-B815的基因組,設(shè)計(jì)引物P1、P2從基因組中擴(kuò)增酸性脲酶全基因組,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-42a-ureABCEFGD,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)中表達(dá),當(dāng)IPTG濃度在0.4 mmol·L~(-1)時(shí),脲酶酶活達(dá)到0.4 U·m L~(-1),EC降解酶酶活達(dá)到0.13 U·m L~(-1)。構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCold-ureABCEFGD在E.coli BL21(DE3)表達(dá),對(duì)形成的包涵體兩次清洗,蛋白回收率達(dá)到53±3%,優(yōu)化了包涵體溶解條件,在含有8 mol·L~(-1)urea、0.05 mmol·L~(-1) DTT、0.05 mol·L~(-1)Arg的緩沖液中(pH8.0)溶解8 h,蛋白質(zhì)回收率達(dá)到95±3%。對(duì)溶解的包涵體復(fù)性,在稀釋復(fù)性中,在GSSG/GSH(氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽)=10/1、精氨酸1.5%(w/v)、20%甘油(v/v)復(fù)性液中稀釋16倍,復(fù)性效果達(dá)到最好;在梯度透析復(fù)性中,在35倍的稀釋復(fù)性液中透析復(fù)性總時(shí)48 h左右時(shí),復(fù)性效果最佳;基于稀釋復(fù)性的稀釋-超濾復(fù)性,在2000 rpm·時(shí),酶活達(dá)到最高。所得脲酶過(guò)鎳柱純化,稀釋復(fù)性的脲酶和EC降解酶酶活8.1±0.8 U·mg~(-1)、2.7±0.3 U·mg~(-1);梯度透析的脲酶和EC降解酶酶活為10.8±1 U·mg~(-1)、3.4±0.3 U·mg~(-1);超濾-稀釋的脲酶和EC降解酶酶活12.3±1 U·mg~(-1)、3.8±0.5 U·mg~(-1),三種方法復(fù)性的蛋白質(zhì)回收率分別為24±5%、22±4%、21±4%。氧化石墨烯(GO)和殼聚糖(CS)復(fù)合微球固定化酸性脲酶,并對(duì)主要條件進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在GO和CS的質(zhì)量比為3/2時(shí),兩者結(jié)合時(shí)間為8 h,戊二醛濃度為2.5%,交聯(lián)8 h后,酶活力回收率可以達(dá)到74%。該固定化脲酶在65℃的半衰期為400 min,在20%乙醇濃度以下可保持80%的酶活;在重復(fù)使用10次后對(duì)底物尿素和EC的催化能力依然保持90%以上。固定化脲酶的Km為9.15 mmol·L~(-1)(尿素),383.86 mmol·L~(-1)(EC),Vmax為1.08μmol·min~(-1)(尿素),0.78μmol·min~(-1)(EC)。考察固定化酸性脲酶在流化床反應(yīng)器中處理黃酒時(shí)的應(yīng)用效果,在加酶量為20 U,流速為0.4 m L·min~(-1)時(shí)反復(fù)處理4次后,50 mL黃酒的尿素的去除率可以達(dá)到93.85%,EC的去除率可以達(dá)到57.46%。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q814
【圖文】：

目的基因的擴(kuò)增圖

M：DL10000 Marker; 1：PCR 產(chǎn)物圖 3-1 目的基因的擴(kuò)增圖Fig.3-1 PCR amplification of ureABCDEFG組擴(kuò)增的基因大小在 5.4 kb 左右，大小符合目的基因的（5437 bp）。酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 徐冰潔;高品;薛罡;鄭博;胡金龍;;苯扎貝特降解酶活力檢測(cè)方法的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究[J];環(huán)境科學(xué)與技術(shù);2014年02期

2 ;有機(jī)膦農(nóng)藥降解酶制劑即將產(chǎn)業(yè)化[J];大氮肥;2006年03期

3 張紅,徐敬友;培養(yǎng)條件對(duì)病原物胞壁降解酶種類和活性的影響[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2005年07期

4 張穎;李寅;華兆哲;陳堅(jiān);;Streptomyces venezuelae GY1產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的培養(yǎng)條件[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào);2005年06期

5 陳麗珍;;丹麥諾沃公司開(kāi)發(fā)新型脂肪降解酶[J];精細(xì)化工信息;1988年08期

6 肖長(zhǎng)生;張武;謝壯奎;曹靜雯;李小玲;;聚乙烯醇降解酶產(chǎn)生菌的分離和發(fā)酵條件[J];微生物學(xué)報(bào);1989年05期

7 孫嘉;郎朗;;有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的研究進(jìn)展[J];資源節(jié)約與環(huán)保;2014年05期

8 陳夕軍;張紅;徐敬友;童蘊(yùn)慧;紀(jì)兆林;;水稻紋枯病菌胞壁降解酶的產(chǎn)生及致病作用[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2006年01期

9 韓秋惠;李沖偉;王梅;金朝霞;李憲臻;;新分離Microbacterium sp.XT11菌產(chǎn)黃原膠降解酶生產(chǎn)條件的優(yōu)化研究[J];生物技術(shù)通報(bào);2006年S1期

10 趙蕾,張?zhí)煊?植物病原菌產(chǎn)生的降解酶及其作用[J];微生物學(xué)通報(bào);2002年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 張穎;李寅;華兆哲;陳堅(jiān);;產(chǎn)聚乙烯醇降解酶的培養(yǎng)條件[A];康地恩杯第八屆全國(guó)染整前處理學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

2 張穎;李寅;沈微;陳堅(jiān);;一株能產(chǎn)生聚乙烯醇降解酶的委內(nèi)瑞拉鏈霉菌[A];第一屆全國(guó)化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文摘要集(下)[C];2004年

3 黃敏;張春芳;;銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)苯甲酸鹽降解酶系統(tǒng)編碼基因ben區(qū)的轉(zhuǎn)座插入突變[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第七次會(huì)議論文摘要匯編[C];1999年

4 錢鼎;堵國(guó)成;陳堅(jiān);;一株聚乙烯醇(PVA)降解酶產(chǎn)生菌的分離及產(chǎn)酶特性研究[A];第四屆中國(guó)酶工程學(xué)術(shù)交流討論會(huì)論文集[C];2003年

5 趙中濤;劉慧泉;安琳;王晨芳;許金榮;;真菌細(xì)胞壁降解酶組的比較基因組學(xué)分析[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2012年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2012年

6 丁賢;張盼;李來(lái)好;殷波;楊賢慶;;海洋微生物信號(hào)降解酶基因aiiA克隆及其序列分析[A];2016年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2016年

7 岳換弟;秦雪梅;王夢(mèng)亮;高芬;;黃芪根腐病菌侵染過(guò)程中幾種細(xì)胞壁降解酶的變化[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2017年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2017年

8 韓文君;古靜燕;李俊剛;顧謙群;吳志紅;李越中;;海洋細(xì)菌Flammeovirga yaeyamensis MY04分泌型多糖降解酶的基因克隆與序列分析[A];2010年第四屆全國(guó)微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2010年

9 王歡;占楊楊;石姣;陳守文;;調(diào)節(jié)聚γ-谷氨酸降解酶PgdS的表達(dá)精確控制γ-PGA分子量[A];第十一屆中國(guó)酶工程學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2017年

10 喬潤(rùn)香;彭星星;鐘國(guó)華;胡美英;;擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥微生物降解研究現(xiàn)狀與方向[A];植物保護(hù)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)——中國(guó)植物保護(hù)學(xué)會(huì)2007年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2007年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 ;高效農(nóng)藥降解酶面世[N];光明日?qǐng)?bào);2002年

2 記者 王曉濤;我國(guó)研制成功國(guó)際領(lǐng)先的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑[N];中國(guó)經(jīng)濟(jì)導(dǎo)報(bào);2006年

3 林一民;我研制出有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑[N];中國(guó)化工報(bào);2006年

4 記者 朱永坤;有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶研制步入工業(yè)化[N];農(nóng)資導(dǎo)報(bào);2007年

5 本報(bào)記者 趙引德;“比亞”降解酶破解農(nóng)藥殘留難題[N];農(nóng)資導(dǎo)報(bào);2006年

6 叢秀明;有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑制成[N];中國(guó)化工報(bào);2006年

7 戴炳仁;“比亞蔬菜瓜果農(nóng)藥降解酶”研制成功[N];中國(guó)國(guó)門時(shí)報(bào);2006年

8 本報(bào)記者 王愛(ài)娥;有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑研制成功[N];農(nóng)資導(dǎo)報(bào);2006年

9 本報(bào)記者　胡其峰;有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑即將產(chǎn)業(yè)化[N];光明日?qǐng)?bào);2006年

10 楊茜;胰島素降解酶可助帶狀皰疹病毒擴(kuò)散[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 江玉姬;有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的篩選及其降解酶特性[D];福建農(nóng)林大學(xué);2006年

2 李凡;聚乳酸生物降解酶及其催化特性研究[D];山東大學(xué);2008年

3 周利;阿爾茲海默癥發(fā)病過(guò)程Aβ降解酶的變化規(guī)律和相互關(guān)系以及初步藥物研究[D];華東理工大學(xué);2016年

4 杜婧;胰島素降解酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其在阿爾茨海默病中的應(yīng)用[D];清華大學(xué);2009年

5 翟逸;擬除蟲(chóng)菊酯降解酶基因的克隆及酶學(xué)性質(zhì)研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

6 宋金龍;煙嘧磺隆降解菌黃籃狀菌（Talaromyces flavus）的分離鑒定及降解機(jī)理研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

7 張娛;腈和苯酚與相關(guān)降解酶之間的分子對(duì)接研究[D];湖南大學(xué);2014年

8 王文爽;海洋細(xì)菌來(lái)源的新型糖胺聚糖降解酶的篩選、鑒定與應(yīng)用[D];山東大學(xué);2017年

9 湯鳴強(qiáng);三唑磷降解菌的分離鑒定及其降解酶特性的研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2012年

10 王戰(zhàn)勇;聚乳酸降解菌的選育及其解聚酶研究[D];東北師范大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王媛;蘆丁降解酶在畢赤酵母中的表達(dá)及其催化機(jī)制分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

2 劉小鋒;雙功能酸性脲酶的全基因表達(dá)與復(fù)性及固定化研究[D];江南大學(xué);2018年

3 劉虎;銅綠假單胞菌GF31氯氰菊酯降解酶的基因克隆及原核表達(dá)[D];廣西大學(xué);2017年

4 劉筱;基于蘋果梨果皮含量水平的酚類物質(zhì)對(duì)Alternaria alternata侵染及胞外降解酶的調(diào)控[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

5 程亮;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解菌及降解酶的研究[D];河南工業(yè)大學(xué);2013年

6 張紅;立枯絲核菌胞壁降解酶及其在致病中的作用[D];揚(yáng)州大學(xué);2004年

7 梅劍秋;果蔬有機(jī)磷殘留農(nóng)藥降解酶菌種的選育及產(chǎn)酶條件的研究[D];哈爾濱商業(yè)大學(xué);2017年

8 宋朝霞;聚乙烯醇降解酶產(chǎn)生菌的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化及酶的初步應(yīng)用研究[D];江南大學(xué);2005年

9 楊廣明;酸性脲酶與氨基甲酸乙酯降解酶產(chǎn)生菌的篩選及酶的特性[D];江南大學(xué);2014年

10 高明;黃曲霉毒素降解酶在釀酒酵母細(xì)胞表面上的展示及酶活性質(zhì)的研究[D];曲阜師范大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2718958