【摘要】：油菜作為冬季種植的油料作物,在我國南方地區(qū)形成了與水稻輪作的種植方式。但目前推廣的甘藍(lán)型油菜品種生育期較長,會影響后茬水稻種植也容易受環(huán)境逆境的影響,從而限制了油菜的推廣使用及土地的高效利用,因此培育生育期較短且產(chǎn)量較高的油菜早熟新品種具有較高的實(shí)際生產(chǎn)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室前期用不同發(fā)育時(shí)期油菜種子為材料通過iFox-Hunting方法建立了一個可誘導(dǎo)油菜基因表達(dá)的擬南芥功能獲得型突變體庫,并從中篩選出一個具有葉片提前衰老表型的突變體rsl-1327。本研究對該突變體的插入基因進(jìn)行研究,并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果深入探討了該突變體在誘導(dǎo)劑處理時(shí)出現(xiàn)葉片提前衰老的作用機(jī)制,為將來利用該突變體插入基因BnACBP1(油菜乙酰輔酶A結(jié)合蛋白1)培育油菜早熟品種提供理論指導(dǎo)。其主要結(jié)果如下:1、首先對突變體rsl-1327的葉片提前衰老表型進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)描述,發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)劑處理情況下4周左右會出現(xiàn)葉片提前衰老表型,且其衰老速率、終花期、成熟期顯著快于野生型擬南芥和未誘導(dǎo)處理突變體。同時(shí)無論是生理水平的葉綠素含量,還是分子水平的衰老marker基因SAG12表達(dá)量都出現(xiàn)了顯著的升高或降低。2、為了深入研究該突變體,我們通過載體引物克隆了突變體rsl-1327的插入基因,并對該基因氨基酸序列的高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白頭部有一個跨膜結(jié)構(gòu)域,且主要由α螺旋和自由卷曲的高級結(jié)構(gòu)組成。隨后對DNA序列進(jìn)行同源比對,發(fā)現(xiàn)該插入基因與ACBP家族的ACBP1同源關(guān)系最近。又因該突變體基因來源于油菜,故將該基因的蛋白序列和油菜、擬南芥的ACBP1蛋白序列進(jìn)行比對,并深入分析了蛋白的功能域,發(fā)現(xiàn)它們蛋白的功能域具有極強(qiáng)的保守性,其中突變體插入基因與油菜A2染色體上的BnaA02g10270D(BnACBP1-2)具有極高的相似性,因此我們認(rèn)為它們之間的微小區(qū)別是由品種間的差異引起。3、為了進(jìn)一步確定突變體的葉片提前衰老表型是否由插入基因引起,我們克隆了突變體基因并將其重新轉(zhuǎn)入擬南芥中,進(jìn)行穩(wěn)定過表達(dá)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)35sBnACBP1-2轉(zhuǎn)基因系同樣出現(xiàn)了葉片提前衰老表型,并且其衰老程度與35sBnACBP1-2的表達(dá)量高低有關(guān)。隨后我們選取了2個轉(zhuǎn)基因系對其葉綠素含量和衰老marker基因SAG12的表達(dá)量進(jìn)行了測定,均說明葉片出現(xiàn)了衰老。同時(shí)利用GFP抗體通過Western Blot在蛋白水平驗(yàn)證了具有葉片提前衰老表型的轉(zhuǎn)基因系中BnACBP1-2蛋白確實(shí)表達(dá)了。4、隨后對油菜中2個ACBP1基因的亞細(xì)胞定位、表達(dá)模式和脂肪酸組成進(jìn)行了分析。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn),油菜ACBP1基因均定位于原生質(zhì)體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜,與擬南芥ACBP1相同。檢測westar油菜中不同組織和時(shí)期BnACBP1的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)其在種子發(fā)育后期、根和花蕾的表達(dá)量較高,并分別克隆油菜2個ACBP1基因的啟動子區(qū)域,通過GUS染色分析發(fā)現(xiàn)其主要在成熟胚、幼苗根部及成熟花粉中表達(dá),與BnACBP1表達(dá)量的分布情況相一致。同時(shí)GUS染色分析還發(fā)現(xiàn)葉片受傷處理后可以被染色,通過檢測受傷處理前后GUS基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)健康葉片中GUS基因也有一定表達(dá),且在受傷處理后大幅升高,這說明BnACBP1可以響應(yīng)受傷刺激。又因BnACBP1蛋白本身與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān),所以我們又測定了BnACBP1-2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因系中脂肪酸的組成,發(fā)現(xiàn)葉片中18碳不飽和脂肪酸的含量增加。這些與擬南芥ACBP1都有差異,因此認(rèn)為油菜的ACBP1基因在功能上可能發(fā)生了分化。5、從DNA水平到蛋白水平確定BnACBP1-2的過表達(dá)會引起葉片的提前衰老之后,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)BnACBP1-2表達(dá)時(shí)α-亞麻酸代謝途經(jīng)和茉莉酸代謝途經(jīng)相關(guān)基因表達(dá)量明顯出現(xiàn)差異,為了驗(yàn)證這一結(jié)果我們測定了35sBnACBP1-2轉(zhuǎn)基因系的茉莉酸和氧化脂類含量,發(fā)現(xiàn)其含量顯著增加,并且茉莉酸處理誘導(dǎo)了BnACBP1的表達(dá)。同時(shí)35s BnACBP1-2在茉莉酸代謝途經(jīng)障礙的突變體lox3、lox4、coi1背景中,葉片提前衰老表型也出現(xiàn)了不同程度的被抑制,由此說明BnACBP1-2過表達(dá)引起的葉片提前衰老與其影響了茉莉酸的代謝途經(jīng)有關(guān)。又因茉莉酸本身在植物抗病蟲害中具有重要意義,故選取了灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)對油菜35s BnACBP1-2轉(zhuǎn)基因系接菌觀察,發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因系對灰葡萄孢菌具有顯著的抗性。通過對本研究結(jié)果的總結(jié),推測BnACBP1-2過表達(dá)引起葉片提前衰老是因其增加了對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不飽和脂肪酸向質(zhì)體的轉(zhuǎn)運(yùn),使質(zhì)體中的亞麻酸含量增加,使得增加的亞麻酸被氧化成氧化脂類,并進(jìn)一步被合成為茉莉酸,導(dǎo)致茉莉酸的積累而啟動下游信號響應(yīng)引起衰老。同時(shí)因BnACBP1可響應(yīng)受傷和茉莉酸處理的誘導(dǎo)表達(dá),且茉莉酸本身與植物抗病蟲害密切相關(guān)。因此對油菜中ACBP1的研究有助于我們深入了解脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)對植物生長發(fā)育及抗病蟲害的影響,對油菜的作物育種和生產(chǎn)也具有重要的理論指導(dǎo)意義。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S565.4
【圖文】：

圖 1. 調(diào)節(jié)葉片衰老的主要過程（Wojciechowska et al 2018）Fig. 1 Main processes that regulate leaf senescence1.1.1.1 葉綠素的降解由于葉綠素?fù)p失，葉片黃化是葉片衰老的第一個可見癥狀，因而與葉綠體變性相關(guān)的葉綠素快速損失經(jīng)常用作衰老開始的生物標(biāo)志。葉綠體蛋白質(zhì)的分解提供了氮的主要來源，葉綠素需要從葉綠素結(jié)合蛋白中去除以使其可以降解（Thomas et al2001），未結(jié)合的葉綠素也對細(xì)胞有毒性，需要適當(dāng)降解以避免自由基產(chǎn)生（Matile1992）。葉綠素降解開始于葉綠體中，并涉及幾個亞細(xì)胞區(qū)室的復(fù)雜酶催化途徑（Thomas et al 2001, H rtensteiner and Feller 2002），其由多個酶促反應(yīng)組成，這些反應(yīng)產(chǎn)生不同短暫壽命的中間體和葉綠素，最終在衰老細(xì)胞的液泡中積累（H rtensteiner and Kr utler 2011）。最近，葉片衰老期間葉綠素分解的調(diào)節(jié)機(jī)制在各

圖 2. 葉片衰老調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Akhtar et al 2018）Fig. 2 The leaf senescence regulatory network葉片發(fā)育經(jīng)歷生長，成熟和衰老階段（Guiboileau et al 2010），其衰老的開始主決于發(fā)育階段的變化。衰老誘導(dǎo)只發(fā)生在特定的發(fā)育階段（Jibran et al 2013），衰老可以通過各種激素和環(huán)境因素誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)。據(jù)觀察，即使在沒有生物和非脅迫的情況下，葉片衰老最終也會以年齡依賴的方式發(fā)生并發(fā)展（Hensel et al

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 陳兆波;余健;;我國油菜生產(chǎn)形勢分析及科研對策研究[J];中國油料作物學(xué)報(bào);2010年02期

2 王漢中;發(fā)展油菜生物柴油的潛力、問題與對策[J];中國油料作物學(xué)報(bào);2005年02期

3 曾珩,楊新筍,夏松波,袁道仁;短生育期油菜品種引種比較及評價(jià)[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2003年03期

4 何宇炯，徐如涓，趙毓橘;表油菜素內(nèi)酯對綠豆幼葉衰老的促進(jìn)作用[J];植物生理學(xué)報(bào);1996年01期

5 蘇正淑;張憲政;;幾種測定植物葉綠素含量的方法比較[J];植物生理學(xué)通訊;1989年05期

本文編號：2718456