【摘要】：目的:肛門直腸畸形(Anorectal Malformations,ARM)是兒科較常見的消化道畸形,世界范圍內(nèi)發(fā)病率約為1/5000~1/1500。廣泛的人體標(biāo)本及動(dòng)物模型研究表明ARM的發(fā)生與基因突變有密切關(guān)聯(lián),但其主效基因尚未明確。在已有的相關(guān)研究中,Eph(Erythopoietin producing hepatoma cell line)家族作為最大的酪氨酸蛋白激酶受體家族參與細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)化及胚胎發(fā)育和腫瘤形成。本研究在Wistar大鼠懷孕第10天時(shí)利用乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)灌胃對(duì)其胎鼠致畸,建立ARM動(dòng)物模型,繼而在基因及蛋白等不同水平檢測(cè)正常胎鼠和ARM胎鼠的肛門直腸發(fā)育過程中直腸末端EphrinB2的表達(dá),旨在探討EphrinB2在正常和肛門直腸畸形的胚胎發(fā)生機(jī)制中的時(shí)空性作用。研究方法:1.動(dòng)物模型的建立選取體重220~280g Wistar雌性大鼠79只,體重250~300g Wistar雄性大鼠(購自中國遼寧長生生物技術(shù)有限公司),按雌雄比例5:1午夜合籠,次日8:00陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子視為受孕,記為懷孕第0天(Embryonic day0,E0),于孕鼠懷孕第10天(E10)經(jīng)胃管給予125 mg/kg的ETU(購于德國Aldrich公司),制作ARM胎鼠動(dòng)物模型,對(duì)照組給予等量的生理鹽水。選擇胎齡13~16天時(shí)剖宮取出完整胚胎,辨別畸形后分為正常組和ARM組。2.免疫組化染色(Immunohistochemical-paraffin section,IHC-P)石蠟包埋:4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定;脫水;石蠟包埋。組織切片:選取胚胎正中矢狀面連續(xù)切片,片厚4μm,選取可以看到直腸和尿道的玻片留存。免疫組化染色:將切片逐步脫蠟水化,抗原熱修復(fù),按說明書依次滴加試劑盒內(nèi)相關(guān)試劑,鏡下觀察DAB及蘇木素染色,自來水沖洗反藍(lán),梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。3.顯微取材于解剖顯微鏡下用顯微器械于無菌條件取生殖結(jié)節(jié)置于EP管中,制作標(biāo)本池,于-80℃冷藏,備Western blot及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)之用。4.Western blot及qRT-PCR在蛋白及分子水平檢測(cè)EphrinB2的表達(dá)情況(1)提取總蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)蛋白定量分析,其結(jié)果經(jīng)ProtoBlot II AP分析系統(tǒng)掃描對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行密度分析,以相對(duì)灰度值代表其蛋白表達(dá)量。(2)提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng),采用2~(-△△ct)分析目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化。5.統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,差異比較采用IBM SPSS Statistics 21統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),以P值表示統(tǒng)計(jì)差異,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.ETU制作ARM胎鼠動(dòng)物模型ETU致畸組中,致畸率可達(dá)89%以上,大體上表現(xiàn)為無尾或短尾畸形,石蠟切片可觀察到ARM胎鼠表現(xiàn)為尿直腸膈未與泄殖腔膜融合,直腸和泌尿生殖道之間存在瘺道,或形成永久泄殖腔。2.免疫組化染色結(jié)果EphrinB2在正常和ARM胎鼠末端直腸胚胎發(fā)育過程中均有表達(dá)。正常組:在胚胎發(fā)育過程中,從E13到E16,表達(dá)逐漸增強(qiáng),呈一個(gè)上升的趨勢(shì),主要表達(dá)在泄殖腔及后腸的粘膜層。在ARM組:EphrinB2在E13~E16表達(dá)強(qiáng)于正常組。3.Western blot及qRT-PCR在蛋白及分子水平檢測(cè)EphrinB2的表達(dá)情況Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示在正常組中EphrinB2的表達(dá)隨著胎齡的增加呈現(xiàn)出上升趨勢(shì),而ARM組的表達(dá)要高于正常組,在E13天差異尤為顯著(P0.05)。結(jié)論:EphrinB2在胎鼠泄殖腔分化、肛門直腸形成時(shí)期有表達(dá),且存在時(shí)空表達(dá)的不平衡,認(rèn)為其可能在大鼠胚胎期泄殖腔和直腸發(fā)育過程中起作用;EphrinB2在畸形組胚胎發(fā)育的中早期,泄殖腔逐漸分化為尿道和消化道時(shí)明顯表達(dá)上調(diào),提示EphrinB2基因在胚胎中早期表達(dá)的增高可能與ARM的發(fā)生相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R725.7
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果胎齡 13 天，正常組：尿直腸膈開始下降把泄殖腔分成腹側(cè)的尿生殖竇和背側(cè)的原始直腸，泄殖腔管呈蝶形。EphrinB2 陽性細(xì)胞分布在泄殖腔上皮，尿直腸膈出僅見少許表達(dá) (圖 1A, B)。 ARM 組：尿直腸膈尖端和泄殖腔膜之間的距離較長。EphrinB2 陽性細(xì)胞密集廣泛分布于尿道，尿直腸膈和后腸上皮 (圖 1C,D)。

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文E14，正常組：尿直腸膈尾端接近泄殖腔膜。EphrinB2 陽性細(xì)胞廣泛分布在尿道和后腸粘膜層，尿直腸膈和泄殖腔膜表達(dá)不明顯（圖 2A, B）。ARM 組：尿直腸膈在泄殖腔里的位置較高，尿直腸膈和泄殖腔膜之間的距離較遠(yuǎn)。EphrinB2陽性細(xì)胞廣泛分布，在尿直腸膈表達(dá)較正常組明顯（圖 2C, D）。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 白玉作;;肛門直腸畸形治療的熱點(diǎn)問題探討[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);年期

2 陳秀蘭;陳思遠(yuǎn);吳永隆;李曉慶;王佚;;先天性低位肛門直腸畸形120例臨床分析[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2017年04期

3 劉鐵軍;何濤;;改良Soave治療肛門直腸畸形術(shù)后糞便潴留綜合征3例[J];包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2008年02期

4 Mboyo A.;Aubert D.;Vrsansky P.;朱新菊;;肛門直腸畸形的特殊類型:新生男嬰肛門直腸閉鎖伴臀部瘺管1例[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(兒科學(xué)分冊(cè));2006年08期

5 韓美蓉;關(guān)曉力;林常青;;嬰幼兒肛門直腸畸形X線診斷[J];中國藥物與臨床;2006年10期

6 白玉作,王維林,黃英,王練英;人類肛門直腸畸形基因表達(dá)譜的研究[J];中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2003年06期

7 王練英,張志波,李正,黃英;肛門直腸畸形-骶骨畸形-骶前腫物四例[J];中華小兒外科雜志;2003年06期

8 白玉作,陳輝,王維林,王偉,袁正偉,李正;肛門直腸畸形患兒術(shù)后30年以上生活質(zhì)量觀察[J];中華小兒外科雜志;2001年01期

9 賈勝琴,戴春娟;142例低位肛門直腸畸形的治療[J];中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生;1998年04期

10 蔣小平，胡廷澤，郎詩民，李福玉;肛門直腸畸形術(shù)后控便功能的觀察[J];四川醫(yī)學(xué);1994年06期

相關(guān)會(huì)議論文 前8條

1 肖蘭福;陳天文;陳順宏;胡家珍;;小兒肛門直腸畸形術(shù)后并發(fā)癥11例臨床分析[A];貴州省醫(yī)學(xué)會(huì)小兒外科分會(huì)第四屆第二次學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

2 雷建明;鄒凱華;;高頻彩超在小兒先天性肛門直腸畸形診斷中的應(yīng)用[A];第十一次全國中西醫(yī)結(jié)合影像學(xué)術(shù)研討會(huì)暨全國中西醫(yī)結(jié)合影像學(xué)研究進(jìn)展學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2010年

3 黃雄;徐偉玨;李會(huì);吳一波;張震;;后矢狀路肛門直腸成形術(shù)一期根治中高位肛門直腸畸形的臨床分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國小兒外科學(xué)術(shù)會(huì)論文集[C];2010年

4 王維林;;我國先天性肛門直腸畸形研究與貢獻(xiàn)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國小兒外科學(xué)術(shù)會(huì)論文集[C];2010年

5 孫小兵;王若義;李殿國;陳維秀;李金良;陳雨歷;;肛門直腸畸形術(shù)后大便失禁的評(píng)價(jià)和治療[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國小兒外科學(xué)術(shù)會(huì)論文集[C];2010年

6 夏航校;陳巧玲;楊潔;毛寬榮;;先天性肛門直腸畸形外科治療的微創(chuàng)化理念[A];中國肛腸病研究心得集[C];2011年

7 賈慧敏;陳青江;張濤;白玉作;袁正偉;王維林;;Notch-1及其受體Jagged-2在肛門直腸畸形大鼠末端直腸腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的表達(dá)變化[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國小兒外科學(xué)術(shù)會(huì)論文集[C];2010年

8 張廷沖;彭春輝;龐文博;李樂;周崇彬;張現(xiàn)偉;陳亞軍;;先天性肛門直腸畸形術(shù)后頑固性便秘合并巨結(jié)腸的臨床特點(diǎn)及處理原則[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國小兒外科學(xué)術(shù)會(huì)論文集[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前5條

1 李群艷;治療“沒屁眼”無需“三步走”[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2005年

2 郭秀芝;恢復(fù)神經(jīng)功能是其治療基礎(chǔ)之一[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

3 王丹邋楊秋蘭 閻紅 特約記者 郭秀芝;讓肛門畸形兒童告別“尿不濕”[N];健康報(bào);2008年

4 李晶;新生寶寶為何“沒屁眼”[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2009年

5 李群艷;先天性無肛 一次性矯治[N];健康報(bào);2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前9條

1 楊中華;肛門直腸畸形胎鼠腰骶髓發(fā)育異常機(jī)制及其宮內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

2 郭俊斌;維甲酸誘導(dǎo)大鼠肛門直腸畸形模型演變規(guī)律、RAR及Hox基因表達(dá)的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2005年

3 張海蘭;肛門直腸畸形泄殖腔凋亡及腸管Cajal間質(zhì)細(xì)胞的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2007年

4 張世偉;正常及先天性肛門直腸畸形大鼠盆底肌肉發(fā)育的對(duì)比研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2008年

5 白玉作;先天性肛門直腸畸形胚胎發(fā)育、基因表達(dá)及遠(yuǎn)期生活質(zhì)量的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2002年

6 王大佳;先天性肛門直腸畸形相關(guān)基因篩選、表達(dá)及多態(tài)性研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2008年

7 黃焱磊;肛門直腸畸形腸壁內(nèi)神經(jīng)支配的相關(guān)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

8 賈慧敏;正常及先天性肛門直腸畸形大鼠及人類腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及調(diào)控的對(duì)比研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2009年

9 張娟;Shh/BMP4信號(hào)在先天性肛門直腸畸形中表達(dá)的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 夏興容;高位肛門直腸畸形結(jié)腸造瘺后二期腹腔鏡輔助肛門成形術(shù)療效分析[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2018年

2 趙晶晶;PPPDE1基因在肛門直腸畸形大鼠胚胎發(fā)育中的時(shí)空性表達(dá)[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

3 袁立珍;PAX1及PAX3基因在肛門直腸畸形大鼠胚胎后腸發(fā)育中的表達(dá)分析[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

4 李盟;TBX4基因在肛門直腸畸形大鼠肛門直腸發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

5 張文果;EphrinB2基因在肛門直腸畸形大鼠胚胎后腸發(fā)育中的表達(dá)分析[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

6 王旗;腹腔鏡輔助與Pena術(shù)治療中高位肛門直腸畸形的薈萃分析[D];蘇州大學(xué);2017年

7 陳思遠(yuǎn);120例先天性肛門直腸低位畸形的臨床分析[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

8 黃德發(fā);濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院二十年肛門直腸畸形患兒回顧性分析[D];山東大學(xué);2016年

9 徐小松;肛門直腸畸形手術(shù)治療療效分析[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

10 張丹;Hoxd-13在肛門直腸畸形大鼠胚胎肛門直腸發(fā)育中表達(dá)的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2716915