發(fā)布時(shí)間：2017-03-28 05:02

  本文關(guān)鍵詞：赭曲霉培養(yǎng)基篩選及AopacC基因?qū)ιL和產(chǎn)毒調(diào)控的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是由青霉屬和曲霉屬產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,廣泛分布在糧食、水果、飼料、咖啡和動(dòng)物性副產(chǎn)品中,被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為2B類潛在致癌物,嚴(yán)重威脅人類健康和食品安全。有效防控農(nóng)產(chǎn)品OTA污染的關(guān)鍵是解析OTA合成途徑及其合成調(diào)控機(jī)理。Pac C作為p H調(diào)控通路中的關(guān)鍵因子,參與多種生命活動(dòng),調(diào)控毒素合成,但目前對(duì)赭曲霉中Pac C的功能研究尚未見報(bào)道。本文研究了赭曲霉在不同培養(yǎng)基上的生長特性和Aopac C基因在赭曲霉p H應(yīng)答中的作用,研究發(fā)現(xiàn):(1)赭曲霉在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)毒差異較大:固體培養(yǎng)基中,赭曲霉在YES培養(yǎng)基上產(chǎn)毒量較高且菌絲發(fā)達(dá),OTA達(dá)到36.09 ng/mm2培養(yǎng)基,可以用YES培養(yǎng)基來進(jìn)行赭曲霉生理特性的研究;天然培養(yǎng)基中,OTA產(chǎn)量最高的是玉米渣培養(yǎng)基,OTA產(chǎn)量達(dá)到251.67μg/g,可以用來進(jìn)行OTA毒理和產(chǎn)毒規(guī)律等研究;赭曲霉在液體培養(yǎng)基中的產(chǎn)毒十分微弱且只在YES培養(yǎng)基中產(chǎn)毒,OTA產(chǎn)量僅為15.39ppb。此外,研究發(fā)現(xiàn)固體培養(yǎng)基上OTA的提取宜采用方便快捷、回收率高的甲醇直接提取法,而在液體中OTA的提取宜選用氯仿萃取法。(2)本研究運(yùn)用同源重組原理和PEG誘導(dǎo)的方法對(duì)赭曲霉Aopac C基因進(jìn)行敲除:通過PCR擴(kuò)增獲得Aopac C上下游片段和潮霉素片段,采用巢式PCR對(duì)三個(gè)片段進(jìn)行融合,將融合目的片段轉(zhuǎn)入赭曲霉原生質(zhì)體中,通過潮霉素抗性篩選,成功獲得赭曲霉3個(gè)轉(zhuǎn)化子,經(jīng)PCR鑒定均為非異位Aopac C突變體,分別命名為:"緼opac C22-1、"緼opac C-3、"緼opac C-5。(3)對(duì)Aopac C進(jìn)行功能分析時(shí)發(fā)現(xiàn),"緼opac C與野生型相比,生長緩慢,OTA合成量減少,致病性顯著降低,并且呈現(xiàn)出p H依賴性。研究赭曲霉中全局調(diào)控基因和基因簇內(nèi)基因的表達(dá)情況時(shí)發(fā)現(xiàn),與野生型對(duì)比,突變體中的OTA合成簇中的關(guān)鍵基因(Aopks,Aobzip,Aohalogenase)的表達(dá)都顯著下調(diào),但是全局調(diào)控基因的表達(dá)在不同p H下表現(xiàn)出差異性,推測Aopac C是通過調(diào)控OTA合成相關(guān)基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)OTA的調(diào)控。此外,本文研究了p H對(duì)赭曲霉生長及代謝的影響:p H對(duì)赭曲霉孢子產(chǎn)量和菌絲形態(tài)沒有顯著影響,但對(duì)其生長、產(chǎn)毒和基因表達(dá)都具有調(diào)控作用,在p H6條件下赭曲霉生長和產(chǎn)毒均達(dá)到最大。
【關(guān)鍵詞】：赭曲霉 赭曲霉毒素A 培養(yǎng)條件 PacC 轉(zhuǎn)錄因子
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TS201.3
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 緒論11-28
• 1.1 赭曲霉毒素A研究概述11-13
• 1.1.1 OTA污染及危害11-12
• 1.1.2 OTA的產(chǎn)生條件及防治12-13
• 1.2 p H對(duì)微生物的影響13-17
• 1.2.1 p H對(duì)微生物生長發(fā)育和代謝的影響13-14
• 1.2.2 p H調(diào)控通路14-17
• 1.3 Pac C的研究進(jìn)展17-26
• 1.3.1 Pac C的發(fā)現(xiàn)與特性17-18
• 1.3.2 Pac C的結(jié)構(gòu)與三種形式18-21
• 1.3.3 Pac C的功能21-26
• 1.4 本研究內(nèi)容及意義26-28
• 第二章 赭曲霉培養(yǎng)基的選擇及OTA提取方法的探究28-38
• 2.1 引言28
• 2.2 試驗(yàn)試劑與儀器28-30
• 2.2.1 試驗(yàn)菌株28
• 2.2.2 培養(yǎng)基28-29
• 2.2.3 主要試劑29
• 2.2.4 儀器與設(shè)備29-30
• 2.3 試驗(yàn)方法30-32
• 2.3.1 赭曲霉在不同培養(yǎng)基上生長和產(chǎn)毒30-31
• 2.3.2 培養(yǎng)基p H的選擇31
• 2.3.3 OTA的提取與檢測31-32
• 2.4 結(jié)果與討論32-37
• 2.4.1 赭曲霉在不同培養(yǎng)基上生長和產(chǎn)毒32-36
• 2.4.2 p H的確定36-37
• 2.4.3 OTA提取方法的確定37
• 2.5 本章小結(jié)37-38
• 第三章 Aopac C突變體的構(gòu)建38-51
• 3.1 引言38
• 3.2 試驗(yàn)材料與儀器38-41
• 3.2.1 試驗(yàn)菌株38
• 3.2.2 培養(yǎng)基及幾種溶液的配制38-39
• 3.2.3 主要試劑39
• 3.2.4 儀器與設(shè)備39-41
• 3.3 試驗(yàn)方法41-46
• 3.3.1 基因組DNA提取41
• 3.3.2 上下游片段的獲取41-43
• 3.3.3 潮霉素片段的獲取43
• 3.3.4 融合片段的獲得43-44
• 3.3.5 原生質(zhì)體的制備44-45
• 3.3.6 轉(zhuǎn)化45
• 3.3.7 轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證45-46
• 3.4 結(jié)果與討論46-50
• 3.4.1 Aopac C基因的序列分析46-48
• 3.4.2 突變體的構(gòu)建48-49
• 3.4.3 轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證49-50
• 3.5 本章小結(jié)50-51
• 第四章 Aopac C基因在赭曲霉p H應(yīng)答中的功能研究51-65
• 4.1 引言51
• 4.2 試驗(yàn)材料與儀器51-52
• 4.2.1 試驗(yàn)材料與菌株51
• 4.2.2 主要試劑及培養(yǎng)基51-52
• 4.2.3 儀器與設(shè)備52
• 4.3 試驗(yàn)方法52-55
• 4.3.1 Aopac C突變體產(chǎn)毒量分析52
• 4.3.2 生長、產(chǎn)孢及OTA合成的測定52-53
• 4.3.3 菌絲形態(tài)的觀察53
• 4.3.4 RNA提取及基因表達(dá)分析53-54
• 4.3.5 致病性54-55
• 4.4 結(jié)果與討論55-64
• 4.4.1 Aopac C突變體產(chǎn)毒量分析55
• 4.4.2 赭曲霉在不同p H條件下的生長狀況55-56
• 4.4.3 赭曲霉在不同p H下的孢子產(chǎn)量56-58
• 4.4.4 赭曲霉在不同p H下的菌絲形態(tài)58-59
• 4.4.5 赭曲霉致病性測定59
• 4.4.6 赭曲霉在不同p H下OTA測定59-60
• 4.4.7 基因表達(dá)量分析60-64
• 4.5 本章小結(jié)64-65
• 第五章 主要結(jié)論與展望65-67
• 5.1 主要結(jié)論65-66
• 5.2 工作展望66-67
• 參考文獻(xiàn)67-81
• 致謝81-83
• 在讀學(xué)位期間發(fā)表的論文83

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 趙鳳敏;梅帥;曹有福;丁進(jìn)鋒;徐嘉杰;李樹君;;基于沼液的培養(yǎng)基及產(chǎn)油小球藻藻種選育[J];環(huán)境科學(xué);2014年06期

2 賈振杰;李慧君;楊清香;張昊;陳建軍;;不同培養(yǎng)基對(duì)富集篩選脫色真菌菌群的效果比較[J];微生物學(xué)通報(bào);2007年04期

3 ;[J];;年期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 張煥英;張?bào)忝?張淵;;茶新菇栽培種培養(yǎng)基篩選[A];中國菌物學(xué)會(huì)第三屆會(huì)員代表大會(huì)暨全國第六屆菌物學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2003年

2 冼海輝;江學(xué)斌;謝雙大;;農(nóng)用抗生素2507的培養(yǎng)基篩選[A];全國生物防治暨第八屆殺蟲微生物學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2000年

3 姜秀芳;鄧春霞;;芋脫毒試管苗培養(yǎng)基研究[A];科技、工程與經(jīng)濟(jì)社會(huì)協(xié)調(diào)發(fā)展——河南省第四屆青年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下冊）[C];2004年

4 徐年軍;張學(xué)成;韓麗君;;均勻設(shè)計(jì)在后棘藻70-01培養(yǎng)基篩選中的應(yīng)用[A];第七屆全國海洋湖沼青年學(xué)者學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2000年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 石正國;培養(yǎng)基試驗(yàn)配制用水和時(shí)間模擬評(píng)估[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉菲;赭曲霉培養(yǎng)基篩選及AopacC基因?qū)ιL和產(chǎn)毒調(diào)控的功能研究[D];江蘇大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：赭曲霉培養(yǎng)基篩選及AopacC基因?qū)ιL和產(chǎn)毒調(diào)控的功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：271671