本文關鍵詞：丹參MAPK基因的克隆及表達分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)為唇形科鼠尾草屬藥用植物,其干燥根莖入藥,丹酚酸B是其主指標性藥用成分之一。植物中的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)能夠被多種生物和非生物脅迫誘導,參與植物生長、發(fā)育和脅迫應答的信號轉導過程。本研究以丹參懸浮培養(yǎng)細胞為材料,用cDNA末端快速擴增技術從丹參中獲得一條MAPK基因并對其cDNA和氨基酸序列進行生物信息學分析。用水楊酸、茉莉酸甲酯、過氧化氫、硝普鈉、氯化鈣、缺鈣和氯化鈉處理丹參懸浮細胞,實時定量PCR(qRT-PCR)分析其對丹參MAPK基因表達。用PEG介導法介導綠色熒光蛋白基因轉入丹參原生質體,激光共聚焦電子顯微鏡觀察綠色熒光蛋白熒光的位置,分析MAPK的亞細胞定位。構建MAPK過表達和RNA干擾(RNA interference,RNAi)載體,并用葉盤法侵染丹參葉片得到過表達和沉默植株,研究MAPK在丹酚酸B合成過程中的作用。取得了以下主要研究結果:1、克隆出編碼MAPK的基因,得到了cDNA全長,命名為SmMAPK6。SmMAPK6全長1467 bp,含有一個1122 bp的開放閱讀框,能夠編碼373個氨基酸,44 bp的5’-非翻譯區(qū)和301 bp的3’-非翻譯區(qū)。2、生物信息學分析預測SmMAPK6編碼的蛋白為一個分子量為42.67 kDa、等電點為5.67且不具信號肽、無跨膜結構的親水性蛋白。屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶大家族,為MAPK蛋白激酶家族TEY亞族成員,有激活位點、ATP結合位點、多肽底物結合位點、A-loop和激酶停泊位點。蛋白序列比對顯示與GhMAPK9和GaMAPK3相似性為85%,包含MAPK的11個基本基序,且在第Ⅶ和第Ⅷ個基序間含有TEY基序。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其為MAPK家族A組成員。3、利用qRT-PCR技術檢測SmMAPK6在丹參植株根、莖和葉中的表達量,結果表明SmMAPK6在葉中表達量最高。用不同激素、信號分子和鹽處理丹參懸浮培養(yǎng)細胞,結果表明,水楊酸、茉莉酸甲酯、過氧化氫、硝普鈉、氯化鈣、缺鈣和氯化鈉都能使SmMAPK6在mRNA水平顯著提高,其中H2O2的處理效果最顯著。4、PEG介導的綠色熒光蛋白基因轉入丹參原生質體,瞬時表達檢測結果顯示,GFP:SmMAPK6融合蛋白的熒光主要分布在細胞核和細胞質。5、構建了SmMAPK6基因的過表達和RNAi沉默表達載體,為后期研究SmMAPK6在丹酚酸B合成積累中的作用提供基礎。
【關鍵詞】：丹參 MAPK 實時定量PCR 亞細胞定位 載體構建
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S567.53
【目錄】：

• 摘要6-8
• abstract8-13
• 第一章 文獻綜述13-21
• 1.1 丹參的藥用價值及研究現(xiàn)狀13
• 1.2 植物MAPK的研究進展13-19
• 1.2.1 MAPK級聯(lián)途徑的基本組成13-14
• 1.2.2 MAPK的結構特點及分類14
• 1.2.3 植物MAPK的功能14-19
• 1.3 選題目的及意義19-21
• 第二章 MAPK基因的克隆及生物信息學分析21-39
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 材料來源21
• 2.1.2 丹參懸浮細胞培養(yǎng)21
• 2.1.3 主要試劑21
• 2.1.4 主要儀器21-22
• 2.2 方法22-30
• 2.2.1 RNA的提取及質量檢測22
• 2.2.2 總RNA質量檢測22
• 2.2.3 cDNA中間片段的克隆22-25
• 2.2.4 3’-RACE的擴增25-26
• 2.2.5 5’-RACE的擴增26-29
• 2.2.6 丹參MAPK基因ORF序列的擴增29-30
• 2.2.7 生物信息學分析所用軟件30
• 2.3 結果與分析30-37
• 2.3.1 丹參MAPK基因全長序列的獲得30-31
• 2.3.2 丹參MAPK的生物信息學分析31-37
• 2.4 討論37-38
• 2.5 小結38-39
• 第三章 丹參MAPK基因的表達分析39-46
• 3.1 材料39
• 3.1.1 材料來源39
• 3.1.2 丹參懸浮細胞的培養(yǎng)39
• 3.1.3 試劑39
• 3.1.4 主要儀器39
• 3.2 方法39-41
• 3.2.1 誘導劑的制備39
• 3.2.2 丹參懸浮細胞的誘導處理39-40
• 3.2.3 MAPK基因表達量的檢測40-41
• 3.3 結果與分析41-44
• 3.3.1 SmMAPK6的組織特異性表達分析41
• 3.3.2 SmMAPK6的誘導表達分析41-44
• 3.4 討論44-45
• 3.5 小結45-46
• 第四章 丹參MAPK的亞細胞定位46-53
• 4.1 材料46
• 4.1.1 植物材料46
• 4.1.2 菌株與質粒46
• 4.1.3 生化試劑46
• 4.1.4 主要儀器46
• 4.2 方法46-49
• 4.2.1 亞細胞定位載體的構建46-48
• 4.2.2 丹參懸浮細胞原生質體的獲得48-49
• 4.2.3 PEG融合法轉化丹參原生質體49
• 4.2.4 顯微鏡觀察49
• 4.3 結果與分析49-51
• 4.3.1 綠色熒光蛋白融合表達載體pA7-GFP-SmMAPK6的構建49-50
• 4.3.2 重組質粒在丹參細胞中的瞬時表達50-51
• 4.4 討論51
• 4.5 小結51-53
• 第五章 SmMAPK6過表達載體和RNAi載體的構建及植株轉化53-63
• 5.1 材料53
• 5.1.1 植物材料53
• 5.1.2 菌株與質粒53
• 5.1.3 生化試劑53
• 5.1.4 主要儀器53
• 5.2 方法53-58
• 5.2.1 植物總RNA的提取及質量檢測53
• 5.2.2 反轉錄53
• 5.2.3 過表達載體的構建53-55
• 5.2.4 RNAi沉默表達載體的構建55-57
• 5.2.5 農桿菌GV3101感受態(tài)的制備57-58
• 5.2.6 葉盤法轉染丹參無菌苗及抗性丹參的獲得58
• 5.3 結果與分析58-60
• 5.3.1 植物過表達載體的構建58-59
• 5.3.2 植物RNAi載體的構建59-60
• 5.4 討論60-61
• 5.5 小結61-63
• 參考文獻63-71
• 附錄71-73
• 縮略詞73-75
• 致謝75-77
• 作者簡介77

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  本文關鍵詞：丹參MAPK基因的克隆及表達分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：271796