發(fā)布時(shí)間：2017-03-28 06:11

  本文關(guān)鍵詞：丹參MAPK基因的克隆及表達(dá)分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)為唇形科鼠尾草屬藥用植物,其干燥根莖入藥,丹酚酸B是其主指標(biāo)性藥用成分之一。植物中的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)能夠被多種生物和非生物脅迫誘導(dǎo),參與植物生長(zhǎng)、發(fā)育和脅迫應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。本研究以丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為材料,用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)從丹參中獲得一條MAPK基因并對(duì)其cDNA和氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。用水楊酸、茉莉酸甲酯、過(guò)氧化氫、硝普鈉、氯化鈣、缺鈣和氯化鈉處理丹參懸浮細(xì)胞,實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)分析其對(duì)丹參MAPK基因表達(dá)。用PEG介導(dǎo)法介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入丹參原生質(zhì)體,激光共聚焦電子顯微鏡觀(guān)察綠色熒光蛋白熒光的位置,分析MAPK的亞細(xì)胞定位。構(gòu)建MAPK過(guò)表達(dá)和RNA干擾(RNA interference,RNAi)載體,并用葉盤(pán)法侵染丹參葉片得到過(guò)表達(dá)和沉默植株,研究MAPK在丹酚酸B合成過(guò)程中的作用。取得了以下主要研究結(jié)果:1、克隆出編碼MAPK的基因,得到了cDNA全長(zhǎng),命名為SmMAPK6。SmMAPK6全長(zhǎng)1467 bp,含有一個(gè)1122 bp的開(kāi)放閱讀框,能夠編碼373個(gè)氨基酸,44 bp的5’-非翻譯區(qū)和301 bp的3’-非翻譯區(qū)。2、生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)SmMAPK6編碼的蛋白為一個(gè)分子量為42.67 kDa、等電點(diǎn)為5.67且不具信號(hào)肽、無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)的親水性蛋白。屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶大家族,為MAPK蛋白激酶家族TEY亞族成員,有激活位點(diǎn)、ATP結(jié)合位點(diǎn)、多肽底物結(jié)合位點(diǎn)、A-loop和激酶停泊位點(diǎn)。蛋白序列比對(duì)顯示與GhMAPK9和GaMAPK3相似性為85%,包含MAPK的11個(gè)基本基序,且在第Ⅶ和第Ⅷ個(gè)基序間含有TEY基序。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其為MAPK家族A組成員。3、利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)SmMAPK6在丹參植株根、莖和葉中的表達(dá)量,結(jié)果表明SmMAPK6在葉中表達(dá)量最高。用不同激素、信號(hào)分子和鹽處理丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,結(jié)果表明,水楊酸、茉莉酸甲酯、過(guò)氧化氫、硝普鈉、氯化鈣、缺鈣和氯化鈉都能使SmMAPK6在mRNA水平顯著提高,其中H2O2的處理效果最顯著。4、PEG介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入丹參原生質(zhì)體,瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示,GFP:SmMAPK6融合蛋白的熒光主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。5、構(gòu)建了SmMAPK6基因的過(guò)表達(dá)和RNAi沉默表達(dá)載體,為后期研究SmMAPK6在丹酚酸B合成積累中的作用提供基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：丹參 MAPK 實(shí)時(shí)定量PCR 亞細(xì)胞定位 載體構(gòu)建
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S567.53
【目錄】：

• 摘要6-8
• abstract8-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-21
• 1.1 丹參的藥用價(jià)值及研究現(xiàn)狀13
• 1.2 植物MAPK的研究進(jìn)展13-19
• 1.2.1 MAPK級(jí)聯(lián)途徑的基本組成13-14
• 1.2.2 MAPK的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及分類(lèi)14
• 1.2.3 植物MAPK的功能14-19
• 1.3 選題目的及意義19-21
• 第二章 MAPK基因的克隆及生物信息學(xué)分析21-39
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 材料來(lái)源21
• 2.1.2 丹參懸浮細(xì)胞培養(yǎng)21
• 2.1.3 主要試劑21
• 2.1.4 主要儀器21-22
• 2.2 方法22-30
• 2.2.1 RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)22
• 2.2.2 總RNA質(zhì)量檢測(cè)22
• 2.2.3 cDNA中間片段的克隆22-25
• 2.2.4 3’-RACE的擴(kuò)增25-26
• 2.2.5 5’-RACE的擴(kuò)增26-29
• 2.2.6 丹參MAPK基因ORF序列的擴(kuò)增29-30
• 2.2.7 生物信息學(xué)分析所用軟件30
• 2.3 結(jié)果與分析30-37
• 2.3.1 丹參MAPK基因全長(zhǎng)序列的獲得30-31
• 2.3.2 丹參MAPK的生物信息學(xué)分析31-37
• 2.4 討論37-38
• 2.5 小結(jié)38-39
• 第三章 丹參MAPK基因的表達(dá)分析39-46
• 3.1 材料39
• 3.1.1 材料來(lái)源39
• 3.1.2 丹參懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)39
• 3.1.3 試劑39
• 3.1.4 主要儀器39
• 3.2 方法39-41
• 3.2.1 誘導(dǎo)劑的制備39
• 3.2.2 丹參懸浮細(xì)胞的誘導(dǎo)處理39-40
• 3.2.3 MAPK基因表達(dá)量的檢測(cè)40-41
• 3.3 結(jié)果與分析41-44
• 3.3.1 SmMAPK6的組織特異性表達(dá)分析41
• 3.3.2 SmMAPK6的誘導(dǎo)表達(dá)分析41-44
• 3.4 討論44-45
• 3.5 小結(jié)45-46
• 第四章 丹參MAPK的亞細(xì)胞定位46-53
• 4.1 材料46
• 4.1.1 植物材料46
• 4.1.2 菌株與質(zhì)粒46
• 4.1.3 生化試劑46
• 4.1.4 主要儀器46
• 4.2 方法46-49
• 4.2.1 亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建46-48
• 4.2.2 丹參懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體的獲得48-49
• 4.2.3 PEG融合法轉(zhuǎn)化丹參原生質(zhì)體49
• 4.2.4 顯微鏡觀(guān)察49
• 4.3 結(jié)果與分析49-51
• 4.3.1 綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體pA7-GFP-SmMAPK6的構(gòu)建49-50
• 4.3.2 重組質(zhì)粒在丹參細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)50-51
• 4.4 討論51
• 4.5 小結(jié)51-53
• 第五章 SmMAPK6過(guò)表達(dá)載體和RNAi載體的構(gòu)建及植株轉(zhuǎn)化53-63
• 5.1 材料53
• 5.1.1 植物材料53
• 5.1.2 菌株與質(zhì)粒53
• 5.1.3 生化試劑53
• 5.1.4 主要儀器53
• 5.2 方法53-58
• 5.2.1 植物總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)53
• 5.2.2 反轉(zhuǎn)錄53
• 5.2.3 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建53-55
• 5.2.4 RNAi沉默表達(dá)載體的構(gòu)建55-57
• 5.2.5 農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)的制備57-58
• 5.2.6 葉盤(pán)法轉(zhuǎn)染丹參無(wú)菌苗及抗性丹參的獲得58
• 5.3 結(jié)果與分析58-60
• 5.3.1 植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建58-59
• 5.3.2 植物RNAi載體的構(gòu)建59-60
• 5.4 討論60-61
• 5.5 小結(jié)61-63
• 參考文獻(xiàn)63-71
• 附錄71-73
• 縮略詞73-75
• 致謝75-77
• 作者簡(jiǎn)介77

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本文編號(hào)：271796