發(fā)布時(shí)間：2020-06-14 08:24

【摘要】：果實(shí)中糖、酸及其糖酸比的水平是決定果實(shí)品質(zhì)和風(fēng)味的重要指標(biāo),本研究的主要目的是對(duì)兩個(gè)與酸度或糖酸比調(diào)節(jié)有關(guān)的基因PHL(PH-LIKE)和AHP5進(jìn)行初步的功能驗(yàn)證。PH是從最近的甜瓜分子遺傳研究發(fā)現(xiàn)的、能夠控制果實(shí)酸度的基因,該基因在擬南芥中的同源基因編碼的蛋白屬于生長(zhǎng)素輸出蛋白家族(PILS),但PH蛋白沒有顯示出任何轉(zhuǎn)運(yùn)體活性且相關(guān)PH基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株并沒有和生長(zhǎng)素有關(guān)的表型,所以PH基因控制果實(shí)酸度的生化機(jī)制還沒有被揭示。本實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的甜橙基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中,AHP5基因可能與糖酸比調(diào)控相關(guān)。鑒于草莓的童期比甜橙短很多,為加速研究進(jìn)程,本研究同時(shí)在甜橙(Citrus sinensis)和二倍體草莓(Fragaria vesca)中進(jìn)行功能的初步驗(yàn)證。由于PH基因所編碼的蛋白是與生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān),使用生長(zhǎng)素等激素處理草莓,以確定生長(zhǎng)素等激素與草莓PHL基因表達(dá)的關(guān)系。在甜橙和草莓不同器官及果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期分別進(jìn)行表達(dá)量分析,初步驗(yàn)證這兩個(gè)基因在甜橙和草莓中的表達(dá)特征。然后通過基因的超量表達(dá)技術(shù)和RNAi技術(shù),分別構(gòu)建植株超量表達(dá)載體和RNAi載體。希望通過改變這兩個(gè)基因在甜橙和草莓的表達(dá)為揭示其調(diào)控果實(shí)酸度和糖酸比的機(jī)制提供材料。主要研究結(jié)果如下:1、FvPHL基因的表達(dá)分析及激素響應(yīng)草莓中的PHL基因?qū)儆谝粋�(gè)小的基因家族,家族中共有6個(gè)基因命名為FvPHL1~FvPHL6。各基因有著不同的表達(dá)模式,FvPHL1/2/6在根、葉、花和果實(shí)中的表達(dá)差異都不顯著;FvPHL3/4/5在一或兩個(gè)器官中有特異表達(dá),FvPHL4在根和果實(shí)中表達(dá)量很低,而在葉和花中的表達(dá)量相對(duì)較高。相反,FvPHL5在根中有較高的表達(dá),在根中的相對(duì)表達(dá)比在其他器官高十幾倍。FvPHL2/3/6在果實(shí)中的表達(dá)相對(duì)較高,尤其是FvPHL3是果實(shí)特異表達(dá)的基因,在果實(shí)的相對(duì)表達(dá)是根中表達(dá)的約180倍,且是花中的4倍。此外,FvPHL各基因表現(xiàn)出果實(shí)發(fā)育和成熟相關(guān)的表達(dá)模式。使用不同濃度(0.01、0.1、1和10μM)的IAA處理草莓。結(jié)果表明,除了FvPHL2和FvPHL4其他四個(gè)FvPHL基因都上調(diào)表達(dá)。用脫落酸(ABA)、6-芐氨基腺嘌呤(BA)、乙烯利(ACC)、赤霉素(GA3)四種激素處理草莓。結(jié)果表明,BA能稍微調(diào)節(jié)FvPHL3/5/6的表達(dá),ACC、GA_3能調(diào)節(jié)FvPHL5的表達(dá),而ABA能夠影響六個(gè)FvPHL基因的表達(dá)。外源激素IAA和ABA似乎對(duì)發(fā)育中的果實(shí)FvPHL基因的表達(dá)沒有影響。2、甜橙和草莓PHL基因、AHP5基因的表達(dá)分析應(yīng)用qRT-PCR對(duì)CsPHL1基因、CsAHP5基因在紐荷爾臍橙不同組織以及果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。CsPHL1基因在紐荷爾臍橙中是普遍表達(dá)的基因,該基因在葉片和花中的表達(dá)較其他器官高,CsPHL1基因隨著果實(shí)發(fā)育表達(dá)量逐漸升高,但變化不是特別明顯。CsAHP5基因在紐荷爾臍橙花中的表達(dá)量最高,隨著果實(shí)發(fā)育該基因表達(dá)量顯著升高,在果實(shí)成熟期表達(dá)量顯著高于果實(shí)發(fā)育其他時(shí)期。同樣應(yīng)用qRT-PCR對(duì)草莓根、葉、花和果實(shí)以及果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期如花后10天、15天、20天、25天的表達(dá)情況進(jìn)行分析,FvPHL1在草莓各個(gè)器官中都有表達(dá),在根中的表達(dá)要比葉和花中高5~10倍,隨著果實(shí)發(fā)育該基因表達(dá)量表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。3、植物表達(dá)載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的基因表達(dá)分析以植物表達(dá)載體pFGC5941或其改造載體pFGC5941M為骨架,構(gòu)建了CsPHL1基因超量表達(dá)載體ZZ302和RNAi載體ZZ305;CsAHP5基因超量表達(dá)載體ZZ321和RNAi載體ZZ320;FvPHL1基因RNAi載體ZZ312;FvAHP5基因RNAi載體ZZ325及其改造載體ZZ325K。通過遺傳轉(zhuǎn)化柑橘和草莓,ZZ302,ZZ305,ZZ321,ZZ325K得到的轉(zhuǎn)基因陽性植株分別為18株,15株,7株,1株。利用qRT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行表達(dá)量分析,CsPHL1基因表達(dá)量升高的過表達(dá)植株1株,表達(dá)量降低的RNAi植株3株。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2;S666.4;S668.4
【圖文】：

第 1 章 文獻(xiàn)綜述碼的CsCit1蛋白能夠介導(dǎo)H+和檸檬酸根離子的電中性共轉(zhuǎn)運(yùn)參與柑橘果實(shí)中檸檬酸從液泡進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而調(diào)控液泡緩沖液含量及 pH。柑橘果實(shí)中的有機(jī)酸主要以檸檬酸為主，檸檬酸的積累主要是發(fā)生在果實(shí)發(fā)育的第二個(gè)時(shí)期，隨著果實(shí)逐漸成熟檸檬酸降解，含量逐漸下降。盛玲（2016）總結(jié)了植物細(xì)胞中檸檬酸的降解主要有兩種途徑：1、GABA 支路，參與 GABA的合成；2、分解為草酰乙酸（OAA）和乙酰輔酶 A（AcCoA）（圖 1-1）。GABA支路是果實(shí)檸檬酸降解的一條途徑首先被 Cercós 等（2006）研究發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞質(zhì)中的檸檬酸在順烏頭酸酶 cyt-Aco 作用下生成異檸檬酸，通過異檸檬酸脫氫酶（NADP-IDH）的作用生成 α-酮戊二酸，然后在谷氨酸脫氫酶的作用下生成谷氨酸；谷氨酸是合成 GABA 的前體，通過谷氨酸脫羧酶（GAD）不可逆催化并消耗質(zhì)子和谷氨酸完成 GABA 的合成。而檸檬酸分解為 OAA 和 AcCoA 是通 ATP-ACL的催化完成。

日常生活中是重要的消費(fèi)品。隨著近年來人們生活水平的提高，人們對(duì)于柑橘果品質(zhì)的要求也越來越高。柑橘水果中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如糖類、維生素及氧化物等。決定水果甜味和成熟的重要指標(biāo)是果實(shí)的糖酸比，因此果實(shí)中的糖有機(jī)酸對(duì)于果實(shí)品質(zhì)非常重要（Albertini et al.，2006；Etienne et al.，，2013； Osoet al.，2013）。果實(shí)中的有機(jī)酸主要是檸檬酸和蘋果酸，糖類主要有蔗糖、葡萄糖和果糖植物的糖酸代謝過程中的酶早已經(jīng)被提出，但至今已有編碼順烏頭酸酶和蘋果脫氫酶的基因被證明其控制果實(shí)的酸度（Centeno et al.，2011；Morgan et al.，2013）最近幾年研究發(fā)現(xiàn) CmPH基因在甜瓜中能夠控制果實(shí)的酸度（Cohen et al.，2014）但生理生化機(jī)制還是不清楚。本實(shí)驗(yàn)室在前期分析了甜橙中紐荷爾臍橙（正常度）、新會(huì)橙（正常酸度）、冰糖橙（低酸）、埃及糖橙（無酸）四個(gè)品種果實(shí)發(fā)過程中的糖酸含量變化，并對(duì)四種甜橙果實(shí)發(fā)育第一階段（花后 45 天，45 DP和果實(shí)發(fā)育第二階段（花后 142 天，142 DPA）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。通過基因共達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，得到 72 個(gè)和糖酸比相關(guān)的基因，在基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中這 72 個(gè)基因于 4 個(gè)模塊（Qiao et al.，2017）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號(hào)：2712516