【摘要】：果實中糖、酸及其糖酸比的水平是決定果實品質(zhì)和風(fēng)味的重要指標(biāo),本研究的主要目的是對兩個與酸度或糖酸比調(diào)節(jié)有關(guān)的基因PHL(PH-LIKE)和AHP5進(jìn)行初步的功能驗證。PH是從最近的甜瓜分子遺傳研究發(fā)現(xiàn)的、能夠控制果實酸度的基因,該基因在擬南芥中的同源基因編碼的蛋白屬于生長素輸出蛋白家族(PILS),但PH蛋白沒有顯示出任何轉(zhuǎn)運體活性且相關(guān)PH基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株并沒有和生長素有關(guān)的表型,所以PH基因控制果實酸度的生化機(jī)制還沒有被揭示。本實驗室先前構(gòu)建的甜橙基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中,AHP5基因可能與糖酸比調(diào)控相關(guān)。鑒于草莓的童期比甜橙短很多,為加速研究進(jìn)程,本研究同時在甜橙(Citrus sinensis)和二倍體草莓(Fragaria vesca)中進(jìn)行功能的初步驗證。由于PH基因所編碼的蛋白是與生長素轉(zhuǎn)運相關(guān),使用生長素等激素處理草莓,以確定生長素等激素與草莓PHL基因表達(dá)的關(guān)系。在甜橙和草莓不同器官及果實發(fā)育不同時期分別進(jìn)行表達(dá)量分析,初步驗證這兩個基因在甜橙和草莓中的表達(dá)特征。然后通過基因的超量表達(dá)技術(shù)和RNAi技術(shù),分別構(gòu)建植株超量表達(dá)載體和RNAi載體。希望通過改變這兩個基因在甜橙和草莓的表達(dá)為揭示其調(diào)控果實酸度和糖酸比的機(jī)制提供材料。主要研究結(jié)果如下:1、FvPHL基因的表達(dá)分析及激素響應(yīng)草莓中的PHL基因?qū)儆谝粋�小的基因家族,家族中共有6個基因命名為FvPHL1~FvPHL6。各基因有著不同的表達(dá)模式,FvPHL1/2/6在根、葉、花和果實中的表達(dá)差異都不顯著;FvPHL3/4/5在一或兩個器官中有特異表達(dá),FvPHL4在根和果實中表達(dá)量很低,而在葉和花中的表達(dá)量相對較高。相反,FvPHL5在根中有較高的表達(dá),在根中的相對表達(dá)比在其他器官高十幾倍。FvPHL2/3/6在果實中的表達(dá)相對較高,尤其是FvPHL3是果實特異表達(dá)的基因,在果實的相對表達(dá)是根中表達(dá)的約180倍,且是花中的4倍。此外,FvPHL各基因表現(xiàn)出果實發(fā)育和成熟相關(guān)的表達(dá)模式。使用不同濃度(0.01、0.1、1和10μM)的IAA處理草莓。結(jié)果表明,除了FvPHL2和FvPHL4其他四個FvPHL基因都上調(diào)表達(dá)。用脫落酸(ABA)、6-芐氨基腺嘌呤(BA)、乙烯利(ACC)、赤霉素(GA3)四種激素處理草莓。結(jié)果表明,BA能稍微調(diào)節(jié)FvPHL3/5/6的表達(dá),ACC、GA_3能調(diào)節(jié)FvPHL5的表達(dá),而ABA能夠影響六個FvPHL基因的表達(dá)。外源激素IAA和ABA似乎對發(fā)育中的果實FvPHL基因的表達(dá)沒有影響。2、甜橙和草莓PHL基因、AHP5基因的表達(dá)分析應(yīng)用qRT-PCR對CsPHL1基因、CsAHP5基因在紐荷爾臍橙不同組織以及果實不同發(fā)育時期的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。CsPHL1基因在紐荷爾臍橙中是普遍表達(dá)的基因,該基因在葉片和花中的表達(dá)較其他器官高,CsPHL1基因隨著果實發(fā)育表達(dá)量逐漸升高,但變化不是特別明顯。CsAHP5基因在紐荷爾臍橙花中的表達(dá)量最高,隨著果實發(fā)育該基因表達(dá)量顯著升高,在果實成熟期表達(dá)量顯著高于果實發(fā)育其他時期。同樣應(yīng)用qRT-PCR對草莓根、葉、花和果實以及果實不同發(fā)育時期如花后10天、15天、20天、25天的表達(dá)情況進(jìn)行分析,FvPHL1在草莓各個器官中都有表達(dá),在根中的表達(dá)要比葉和花中高5~10倍,隨著果實發(fā)育該基因表達(dá)量表現(xiàn)出上升的趨勢。3、植物表達(dá)載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的基因表達(dá)分析以植物表達(dá)載體pFGC5941或其改造載體pFGC5941M為骨架,構(gòu)建了CsPHL1基因超量表達(dá)載體ZZ302和RNAi載體ZZ305;CsAHP5基因超量表達(dá)載體ZZ321和RNAi載體ZZ320;FvPHL1基因RNAi載體ZZ312;FvAHP5基因RNAi載體ZZ325及其改造載體ZZ325K。通過遺傳轉(zhuǎn)化柑橘和草莓,ZZ302,ZZ305,ZZ321,ZZ325K得到的轉(zhuǎn)基因陽性植株分別為18株,15株,7株,1株。利用qRT-PCR對轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行表達(dá)量分析,CsPHL1基因表達(dá)量升高的過表達(dá)植株1株,表達(dá)量降低的RNAi植株3株。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S666.4;S668.4
【圖文】：

第 1 章 文獻(xiàn)綜述碼的CsCit1蛋白能夠介導(dǎo)H+和檸檬酸根離子的電中性共轉(zhuǎn)運參與柑橘果實中檸檬酸從液泡進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而調(diào)控液泡緩沖液含量及 pH。柑橘果實中的有機(jī)酸主要以檸檬酸為主，檸檬酸的積累主要是發(fā)生在果實發(fā)育的第二個時期，隨著果實逐漸成熟檸檬酸降解，含量逐漸下降。盛玲（2016）總結(jié)了植物細(xì)胞中檸檬酸的降解主要有兩種途徑：1、GABA 支路，參與 GABA的合成；2、分解為草酰乙酸（OAA）和乙酰輔酶 A（AcCoA）（圖 1-1）。GABA支路是果實檸檬酸降解的一條途徑首先被 Cercós 等（2006）研究發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞質(zhì)中的檸檬酸在順烏頭酸酶 cyt-Aco 作用下生成異檸檬酸，通過異檸檬酸脫氫酶（NADP-IDH）的作用生成 α-酮戊二酸，然后在谷氨酸脫氫酶的作用下生成谷氨酸；谷氨酸是合成 GABA 的前體，通過谷氨酸脫羧酶（GAD）不可逆催化并消耗質(zhì)子和谷氨酸完成 GABA 的合成。而檸檬酸分解為 OAA 和 AcCoA 是通 ATP-ACL的催化完成。

日常生活中是重要的消費品。隨著近年來人們生活水平的提高，人們對于柑橘果品質(zhì)的要求也越來越高。柑橘水果中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)如糖類、維生素及氧化物等。決定水果甜味和成熟的重要指標(biāo)是果實的糖酸比，因此果實中的糖有機(jī)酸對于果實品質(zhì)非常重要（Albertini et al.，2006；Etienne et al.，，2013； Osoet al.，2013）。果實中的有機(jī)酸主要是檸檬酸和蘋果酸，糖類主要有蔗糖、葡萄糖和果糖植物的糖酸代謝過程中的酶早已經(jīng)被提出，但至今已有編碼順烏頭酸酶和蘋果脫氫酶的基因被證明其控制果實的酸度（Centeno et al.，2011；Morgan et al.，2013）最近幾年研究發(fā)現(xiàn) CmPH基因在甜瓜中能夠控制果實的酸度（Cohen et al.，2014）但生理生化機(jī)制還是不清楚。本實驗室在前期分析了甜橙中紐荷爾臍橙（正常度）、新會橙（正常酸度）、冰糖橙（低酸）、埃及糖橙（無酸）四個品種果實發(fā)過程中的糖酸含量變化，并對四種甜橙果實發(fā)育第一階段（花后 45 天，45 DP和果實發(fā)育第二階段（花后 142 天，142 DPA）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。通過基因共達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，得到 72 個和糖酸比相關(guān)的基因，在基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中這 72 個基因于 4 個模塊（Qiao et al.，2017）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2712516