發(fā)布時間：2020-06-12 13:24

【摘要】：研究背景:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染導致的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國最重要的死亡原因之一。體細胞變異是HCC進化的基礎(chǔ),而HBV基因整合是HBV-HCC特有的突變類型,也是HBV直接損傷人體基因組的方式。大量研究發(fā)現(xiàn)HBV整合事件在HCC基因組中積累,提示這類突變可以賦予變異細胞生存優(yōu)勢,進而促進癌癥發(fā)生。目前該領(lǐng)域的研究存在以下局限性:首先,關(guān)于HBV整合的研究都局限在基因組水平,缺乏轉(zhuǎn)錄組水平的研究�；蚪M水平的HBV整合突變影響基因轉(zhuǎn)錄的方式和程度尚不明確;前基因組RNA的合成與逆轉(zhuǎn)錄是HBV復制的關(guān)鍵步驟,目前不能確定在相關(guān)過程中病毒RNA是否可以直接整合到人體RNA鏈。其次,個體間的HBV突變譜差異較大,阻礙了HBV整合突變的有效檢測和全面分析。第三,目前僅有TERT和MLL4基因被證實為常見的HBV整合基因,上述2種基因中的HBV整合突變僅占此類突變總量的2%以下;其余大量HBV整合突變的促癌功能尚待研究。最后,HBV整合的發(fā)生機制也不明確。載脂蛋白B mRNA編輯多肽3家族(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide 3,APOBECE3)是誘導體細胞突變和病毒突變產(chǎn)生的重要分子,可以誘導人體和病毒核酸鏈斷裂,但是尚無研究闡明APOBEC3對HBV整合的作用。HBV-HCC的發(fā)生發(fā)展是遺傳、免疫和病毒因素共同作用的進化過程。研究APOBEC3的單核甘酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)在病毒突變和癌癥發(fā)生中的作用對明確HBV致癌過程有重要意義。研究目的:明確HBV整合在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平的分布規(guī)律;研究HBV整合的發(fā)生機制以及這類突變在肝細胞癌進化過程中的作用;闡明APOBEC3致突變基因與HBV整合的關(guān)系;分析APOBEC3遺傳多態(tài)性與病毒清除、病毒突變和HCC風險的相關(guān)性;為HBV感染者的癌癥防治提供新靶點。研究方法:應(yīng)用50例HCC患者的癌和癌旁組織進行HBV-捕獲測序以及RNA測序。以HBV各基因型的標準序列為基礎(chǔ),利用患者體內(nèi)的HBV突變信息進行校正,生成每個患者個體化的病毒參考序列。將測序片段與人核基因組、線粒體基因組以及病毒基因組參考序列進行比對,確定HBV整合突變。隨機挑選80個DNA和RNA水平的整合位點,以巢式PCR和Sanger測序的方法進行驗證。分別利用標準化配對測序片段數(shù)(support PE-assembled reads,NNSS)和嵌合測序片段數(shù)(reads)評價DNA和RNA水平的整合突變信號強度。在DNA水平,NNSS≥1的HBV整合突變納入分析;在RNA水平,reads≥2的HBV整合突變納入分析。以χ2檢驗分析HBV整合突變在人基因組、病毒基因組以及人群間的分布特征。為排除低頻隨機整合的影響,以HBV整合突變信號強度的上四分位點為界值,篩選高強度的整合突變,重復驗證HBV整合突變分布規(guī)律。采用Wilcoxon非參數(shù)秩和檢驗分析HBV整合突變的數(shù)量差異;以t檢驗或方差分析評價基因表達水平的差異;以Pearson相關(guān)性檢驗分析APOBEC3表達與HBV整合突變的相關(guān)性;以Log-Rank檢驗評價HBV整合突變對HCC患者預后及復發(fā)的影響;以KEGG和GSEA分析確定HBV整合突變顯著影響的信號通路和生物功能。P0.05則判定差異具有統(tǒng)計學意義。下載HCC人群的高通量測序和表達譜公共數(shù)據(jù)庫,包括HBV捕獲測序數(shù)據(jù)庫(SRP068532,426例樣本)、癌癥基因組聯(lián)盟(The Cancer Genome Atlas,TCGA)的HCC隨訪隊列數(shù)據(jù)庫(LIHC,366例)以及基因表達數(shù)據(jù)集(Gene Expression Omnibus,GEO)的HCC表達譜數(shù)據(jù)庫(GSE14520,242例)。利用上述數(shù)據(jù)庫對本研究發(fā)現(xiàn)的HBV整合突變規(guī)律及功能進行驗證。挑選APOBEC3A、APOBEC3B、以及DNA修復基因UNG的4個SNP位點進行研究。使用熒光定量PCR的方法對1449例健康對照和3772例HBV感染者(包括1271例HCC患者)進行SNP分型,使用巢式PCR擴增病毒preS和BCP區(qū)片段,使用MEGA軟件分析病毒突變。用logistic回歸計算SNP基因型與病毒清除、病毒突變以及HCC風險的相關(guān)性。研究結(jié)果:1.DNA和RNA水平的HBV整合規(guī)律有顯著差異以HBV突變信息校正參考序列,可以提高HBV整合事件的檢出率。本研究在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平分別檢測到HBV整合突變2777個和2918個。在DNA水平,癌癥組織中的HBV整合數(shù)量顯著高于癌旁組織(P=1.0×10~(-4));HCC術(shù)后未復發(fā)人群→HCC術(shù)后晚期復發(fā)人群(大于2年)→HCC術(shù)后早期復發(fā)人群(小于等于2年)的癌癥組織中,HBV整合突變數(shù)量逐漸升高。在RNA水平,癌癥組織中的HBV整合數(shù)量顯著少于癌旁組織(P=1.2×10~(-3));各HCC進化階段的人群之間,HBV整合突變數(shù)量沒有顯著差別。DNA水平的HBV整合突變僅有0.5%分布在線粒體基因組,而RNA水平的HBV整合突變則有19.43%分布在線粒體基因組。這一差別在驗證隊列中得到重復。2、HBV X片段是整合入人體基因組的主要片段HBV X區(qū)(nt1374-nt1835)的整合事件數(shù)在DNA水平、RNA線粒體基因組水平以及RNA核基因組水平的比例分別為31.6%,35.1%,以及58.0%,顯著高于隨機整合率(14%)。在高信號強度的HBV整合突變中,HBV X片段的比例更高。3、HBV高頻整合基因在DNA水平,292個基因在≥2個樣本中均檢測到HBV整合突變,定義為重復整合基因;其中僅有11個(3%)在RNA水平也被鑒定為重復整合基因;只有2個(MLL4和TERT,0.6%)可以在同一樣本的DNA和RNA數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)高度一致的HBV整合突變。在DNA水平,TERT的HBV整合突變檢出率最高(16%),全部分布在啟動子區(qū)。在RNA水平,ALB的HBV整合檢出率最高(51%);同時,全部13個線粒體編碼基因均發(fā)生了HBV整合突變,而且重復檢出率均在13.2%-43%。4、HBV整合與基因表達的相關(guān)性在DNA水平,TERT啟動子區(qū)的HBV整合與TERT基因在癌癥組織中的表達升高有關(guān)(P=3.89×10~(-8));同時TERT上游3kb區(qū)域中HBV X片段的反向插入也有促進TERT表達的趨勢;MLL4、MT-ND4等重復整合基因的表達水平與HBV在DNA鏈的整合無關(guān)。在RNA水平,MLL4、ALB、HP、MT-CO2和MT-CYB上的HBV整合突變與基因表達水平升高有顯著相關(guān)性。5、HBV整合突變相關(guān)的信號通路DNA水平的整合突變顯著富集于PI3K-mTOR通路和染色質(zhì)重塑通路,通路整體整合突變率分別為30%和20%。RNA水平的整合突變顯著富集于IL2-STAT5和IL6-STAT3等炎癥通路。6、HBV整合對HCC預后的影響癌旁組織中DNA水平的HBV整合總數(shù)過高預示早期復發(fā)(P=0.012),該作用在驗證隊列中得到重復(P=0.014)。RNA水平上,癌旁組織中核基因組以及線粒體基因組上的整合突變總數(shù)過高,均可以預示HCC患者整體生存預后不良(P=0.027,0.033)。7、APOBEC3表達與HBV整合的相關(guān)性癌組織中APOBEC3A的表達與DNA和RNA水平的HBV整合突變總數(shù)呈顯著正相關(guān)(DNA:Pearson相關(guān)系數(shù)=0.374,P=0.008;RNA:Pearson相關(guān)系數(shù)=0.302,P=0.035);UNG的表達與RNA水平的HBV整合突變總數(shù)呈顯著負相關(guān)(RNA:Pearson相關(guān)系數(shù)=-0.388,P=0.008);癌旁組織中APOBEC3B的表達量與RNA水平的HBV整合突變總數(shù)呈顯著正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)=0.322,P=0.024)。癌癥組織中APOBEC3A、APOBEC3B和UNG的表達升高均與HCC的預后不良有顯著相關(guān)性;APOBEC特征性體細胞突變數(shù)僅在非HBV感染的HCC中與患者預后不良有顯著相關(guān)性,但在HBV感染導致的HCC患者中與預后無關(guān)。8、APOBEC3B和UNG SNP與HCC發(fā)生風險的關(guān)系在HBV感染人群中,校正性別和年齡因素后,APOBEC3B的rs2267401 TG+GG基因型可以顯著增加HCC發(fā)生風險[AOR(95%CI)=1.52(1.226-1.889)];UNG的rs3890995 TC+CC基因型可以顯著增加HCC發(fā)生風險[AOR(95%CI)=1.28(1.109-1.477)]。9、APOBEC3B和UNG SNP與HBV突變的關(guān)系在HBV基因型C感染人群中,校正性別和年齡因素后,rs2267401 TG+GG基因型顯著增加APOBEC相關(guān)的病毒突變水平,同時顯著增加A1762T/G1764A的發(fā)生頻率;rs3890995 TC+CC基因型顯著增加G146C等11個促癌病毒突變的發(fā)生頻率。10、APOBEC3B和UNG SNP與HBV突變在乙肝后肝癌中的交互作用在HBV基因型C感染人群中,校正性別和年齡因素后,rs2267401 TG+GG與A1762T/G1764A的交互作用顯著升高HCC發(fā)生風險[AOR(95%CI)=6.05(3.407-10.726)],rs3890995 TG+GG基因型與G146C的交互作用顯著升高HCC發(fā)生風險[AOR(95%CI)=4.14(2.679-6.399)]。研究結(jié)論:1、HBV整合突變的分布規(guī)律在DNA和RNA水平存在顯著差異,絕大多數(shù)RNA水平的HBV整合突變不是由DNA的整合突變轉(zhuǎn)錄而來,而是在RNA鏈上直接插入病毒片段導致。2、RNA水平的HBV整合顯著影響線粒體有氧氧化呼吸鏈的相關(guān)基因,DNA水平的HBV整合基因顯著富集致癌通路;基因組和轉(zhuǎn)錄組水平的HBV整合事件數(shù)量過高均與預后不良有顯著相關(guān)性,初步明確了HBV整合的促癌作用。3、發(fā)現(xiàn)RNA水平整合突變的發(fā)生與致突變基因APOBEC3A、APOBEC3B的表達呈正相關(guān),同時也與體內(nèi)炎癥免疫通路密切相關(guān);初步證明炎癥通路刺激下誘變分子表達升高可以促進HBV整合突變的產(chǎn)生。4、APOBEC3A、APOBEC3B以及UNG的表達水平可以影響HCC患者預后,但APOBEC特征性的突變僅在非HBV感染導致的HCC患者中與預后相關(guān);APOBEC3B和UNG的SNP位點(rs2267401和rs3890995)可以通過促進高危HBV突變產(chǎn)生,進而增加癌癥風險;提示在HBV-HCC中,APOBEC3A、APOBEC3B和UNG不是通過直接損傷人體基因組致癌,而是通過與HBV相互作用導致癌癥發(fā)生。
【圖文】：

HBV整合突變位點的Sanger測序驗證結(jié)果

圖 1.2 HBV 整合突變在 DNA 水平和 RNA 水平的陽性上圖和下圖分別展示了 HCC 組織和癌旁組織的 HBV 整合突變檢出率，，每一格色代表檢測陽性，白色代表檢測陰性。表 1.4：DNA 水平 HBV 整合位點的 Sanger 測序驗證表樣本 基因 reads NNSS 人基因組位置 HBV 位置 T085277 MLL4 567 354.14 Chr19:35722018 3108 T080411 TERT 798 317.55 Chr5:1295370 1801 T116019 CTNNA2 337 185.69 Chr2:80551389 1574 T068456 RALYL 209 95.04 Chr8:84801504 1315 N055965 SPSB4 68 48.77 Chr3:141139379 1839 N074723 FN1 18 13.60 Chr2:215381782 735 T070764 PDS5B 30 13.42 Chr13:32660439 1009 N095896 ITCH 13 11.56 Chr20:34490358 927
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

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