【摘要】：目的應用慢病毒法構(gòu)建PAQR3基因過表達胃癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。研究PAQR3過表達對胃癌生物學行為的影響。并對PAQR3過表達是否影響胃癌干細胞特性方面進行了初步探討。方法首先,我們采用基因克隆技術(shù),通過獲取PAQR3基因并擴增,基因載體選取與剪切,PAQR3基因與載體連接,重組載體導入感受態(tài)細胞和重組DNA的篩選實驗過程,構(gòu)建真核表達質(zhì)粒PAQR3-CD513。利用PCR實驗、雙酶切驗證和基因測序鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。將PAQR3-CD513質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒GFP-CD513分別與輔助質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染293T細胞,PAQR3、GFP過表達慢病毒分別感染BGC823細胞。熒光顯微鏡下觀察和puro篩選,驗證BGC823穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系是否順利構(gòu)建。Western blot實驗驗證穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中PAQR3基因究竟是否順利表達。在確認穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構(gòu)建成功后,將PAQR3-BGC823穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞命名為PAQR3組(實驗組),GFP-BGC823穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞即為對照組。采用MTT法檢測PAQR3組和對照組細胞的增殖能力;細胞劃痕實驗比較PAQR3組和對照組細胞的遷移面積比率;裸鼠皮下注射PAQR3組和對照組細胞后,觀察出瘤情況、測量腫瘤大小,計算腫瘤體積。裸鼠處死后剝離腫瘤稱重。采用Western blot實驗檢測PAQR3組和對照組CSC標志物ALDH1A1蛋白的表達。RT-PCR實驗檢測兩組細胞干性相關基因OCT4和SOX2相對表達量。結(jié)果1、PCR法克隆并擴增獲得PAQR3 DNA分子片段。雙酶切產(chǎn)物電泳分析顯示1號克隆在與PAQR3 DNA分子大小相一致位置出現(xiàn)明顯的陽性條帶。1號克隆質(zhì)粒測序分析,測序可信區(qū)域內(nèi)所涵蓋序列與標準序列一致,1號克隆質(zhì)粒為PAQR3-CD513的陽性重組子。表明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。PAQR3、GFP過表達慢病毒分別感染BGC823細胞,熒光顯微鏡下,對照組GFP-BGC823細胞有較強綠色熒光信號,PAQR3-BGC823細胞沒有GFP基因,無熒光信號。嘌呤霉素(puro)篩選可以確定PAQR3病毒感染成功。Western blot結(jié)果顯示,PAQR3-BGC823穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中PAQR3蛋白表達水平顯著高于GFP-BGC823穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞。成功構(gòu)建慢病毒PAQR3基因過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。2、MTT實驗結(jié)果顯示,PAQR3組細胞的生長速度低于對照組(P0.05)。3、細胞劃痕實驗結(jié)果顯示:PAQR3組遷移面積比率(0.48±0.013)%小于對照組遷移面積比率(0.63±0.012)%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4、細胞劃痕實驗結(jié)果顯示:PAQR3組遷移面積比率(0.48±0.013)%小于對照組遷移面積比率(0.63±0.012)%,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)5、PAQR3過表達組和對照組細胞分別在裸鼠皮下注射,PAQR3組腫瘤的生長速度低于相應對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);剝離出兩組瘤體,PAQR3組瘤塊整體小于對照組;PAQR3組瘤塊重量小于對照組瘤塊重量,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。6、Western Blot結(jié)果顯示:對照組灰度值為(0.673±0.021),PAQR3組灰度值為(0.582±0.015),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與對照組相比,PAQR3組ALDH1A1蛋白的表達量減少,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)。7、RT-PCR結(jié)果顯示,與對照組比較,PAQR3組干性相關基因OCT4和SOX2表達量均下降(P0.05)。結(jié)論1、成功構(gòu)建慢病毒介導的PAQR3過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。2、PAQR3基因抑制胃癌細胞增殖、遷移及裸鼠成瘤能力,是一種抑癌基因。3、PAQR3基因表達上調(diào)減少腫瘤干細胞標志物ALDH1A1的蛋白表達,降低干性相關基因OCT4和SOX2表達。PAQR3基因發(fā)揮抑制胃癌干細胞特性作用。可以作為胃癌的靶向基因。
【圖文】：

圖1-1. pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro質(zhì)粒圖譜主要試劑名稱 公司等 培養(yǎng)基 HyeloneGibco胰蛋白酶 HyClone上海生物工程取試劑盒 北京艾德萊試劑盒 TaKaRa劑盒 TaKaRaI TaKaRa TaKaRa

了PAQR3 DNA分子片段（圖A），同時對慢病毒表達載體CD513質(zhì)粒進行BamHI,EcoRI雙酶切，線性化的CD513質(zhì)粒如圖B所示，后續(xù)經(jīng)連接轉(zhuǎn)化DH5αE.coli感受態(tài)細胞后，次日隨機挑取3個單克隆菌落進行擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，再次進行BamHI, EcoRI雙酶切處理后，酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，其中1號克隆在與PAQR3 DNA分子大小相一致的位置出現(xiàn)了明顯的陽性條帶，隨即對1號克隆質(zhì)粒進行測序分析(圖1-2.D)，并與標準序列進行比對分析，，結(jié)果顯示測序可信區(qū)域內(nèi)所涵蓋序列與標準序列的相似度為100%（圖1-2.E），據(jù)此確認1號克隆質(zhì)粒為PAQR3-CD513的陽性重組子，且序列正確。
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 曾颯;秦曉東;何祥一;車春曉;張瀟;解斯羽;孫貴軍;王立鶴;;慢病毒介導過表達端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的人口腔黏膜上皮穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建[J];華西口腔醫(yī)學雜志;2016年05期

2 宋杰;陳鳳格;趙偉;趙冬;;胃癌的發(fā)病率現(xiàn)狀與治療研究進展[J];中國慢性病預防與控制;2016年09期

3 孟雪萍;王玉平;郭慶紅;周永寧;;胃癌干細胞研究進展[J];胃腸病學和肝病學雜志;2015年10期

4 季加孚;;我國胃癌防治研究三十年回顧[J];中國腫瘤臨床;2013年22期

5 朱佳懷;田光;;水系災害醫(yī)學救援中的衛(wèi)生防病措施[J];中國急救復蘇與災害醫(yī)學雜志;2011年06期

本文編號：2710035