【摘要】：目的應(yīng)用慢病毒法構(gòu)建PAQR3基因過(guò)表達(dá)胃癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。研究PAQR3過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌生物學(xué)行為的影響。并對(duì)PAQR3過(guò)表達(dá)是否影響胃癌干細(xì)胞特性方面進(jìn)行了初步探討。方法首先,我們采用基因克隆技術(shù),通過(guò)獲取PAQR3基因并擴(kuò)增,基因載體選取與剪切,PAQR3基因與載體連接,重組載體導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞和重組DNA的篩選實(shí)驗(yàn)過(guò)程,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒PAQR3-CD513。利用PCR實(shí)驗(yàn)、雙酶切驗(yàn)證和基因測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。將PAQR3-CD513質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒GFP-CD513分別與輔助質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,PAQR3、GFP過(guò)表達(dá)慢病毒分別感染BGC823細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察和puro篩選,驗(yàn)證BGC823穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是否順利構(gòu)建。Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中PAQR3基因究竟是否順利表達(dá)。在確認(rèn)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功后,將PAQR3-BGC823穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞命名為PAQR3組(實(shí)驗(yàn)組),GFP-BGC823穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞即為對(duì)照組。采用MTT法檢測(cè)PAQR3組和對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)比較PAQR3組和對(duì)照組細(xì)胞的遷移面積比率;裸鼠皮下注射PAQR3組和對(duì)照組細(xì)胞后,觀察出瘤情況、測(cè)量腫瘤大小,計(jì)算腫瘤體積。裸鼠處死后剝離腫瘤稱重。采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PAQR3組和對(duì)照組CSC標(biāo)志物ALDH1A1蛋白的表達(dá)。RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞干性相關(guān)基因OCT4和SOX2相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果1、PCR法克隆并擴(kuò)增獲得PAQR3 DNA分子片段。雙酶切產(chǎn)物電泳分析顯示1號(hào)克隆在與PAQR3 DNA分子大小相一致位置出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性條帶。1號(hào)克隆質(zhì)粒測(cè)序分析,測(cè)序可信區(qū)域內(nèi)所涵蓋序列與標(biāo)準(zhǔn)序列一致,1號(hào)克隆質(zhì)粒為PAQR3-CD513的陽(yáng)性重組子。表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。PAQR3、GFP過(guò)表達(dá)慢病毒分別感染BGC823細(xì)胞,熒光顯微鏡下,對(duì)照組GFP-BGC823細(xì)胞有較強(qiáng)綠色熒光信號(hào),PAQR3-BGC823細(xì)胞沒(méi)有GFP基因,無(wú)熒光信號(hào)。嘌呤霉素(puro)篩選可以確定PAQR3病毒感染成功。Western blot結(jié)果顯示,PAQR3-BGC823穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中PAQR3蛋白表達(dá)水平顯著高于GFP-BGC823穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。成功構(gòu)建慢病毒PAQR3基因過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。2、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PAQR3組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度低于對(duì)照組(P0.05)。3、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:PAQR3組遷移面積比率(0.48±0.013)%小于對(duì)照組遷移面積比率(0.63±0.012)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:PAQR3組遷移面積比率(0.48±0.013)%小于對(duì)照組遷移面積比率(0.63±0.012)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)5、PAQR3過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞分別在裸鼠皮下注射,PAQR3組腫瘤的生長(zhǎng)速度低于相應(yīng)對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);剝離出兩組瘤體,PAQR3組瘤塊整體小于對(duì)照組;PAQR3組瘤塊重量小于對(duì)照組瘤塊重量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6、Western Blot結(jié)果顯示:對(duì)照組灰度值為(0.673±0.021),PAQR3組灰度值為(0.582±0.015),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與對(duì)照組相比,PAQR3組ALDH1A1蛋白的表達(dá)量減少,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7、RT-PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,PAQR3組干性相關(guān)基因OCT4和SOX2表達(dá)量均下降(P0.05)。結(jié)論1、成功構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的PAQR3過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。2、PAQR3基因抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及裸鼠成瘤能力,是一種抑癌基因。3、PAQR3基因表達(dá)上調(diào)減少腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物ALDH1A1的蛋白表達(dá),降低干性相關(guān)基因OCT4和SOX2表達(dá)。PAQR3基因發(fā)揮抑制胃癌干細(xì)胞特性作用�？梢宰鳛槲赴┑陌邢蚧�。
【圖文】：

圖1-1. pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro質(zhì)粒圖譜主要試劑名稱 公司等 培養(yǎng)基 HyeloneGibco胰蛋白酶 HyClone上海生物工程取試劑盒 北京艾德萊試劑盒 TaKaRa劑盒 TaKaRaI TaKaRa TaKaRa

了PAQR3 DNA分子片段（圖A），同時(shí)對(duì)慢病毒表達(dá)載體CD513質(zhì)粒進(jìn)行BamHI,EcoRI雙酶切，線性化的CD513質(zhì)粒如圖B所示，后續(xù)經(jīng)連接轉(zhuǎn)化DH5αE.coli感受態(tài)細(xì)胞后，次日隨機(jī)挑取3個(gè)單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，再次進(jìn)行BamHI, EcoRI雙酶切處理后，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，其中1號(hào)克隆在與PAQR3 DNA分子大小相一致的位置出現(xiàn)了明顯的陽(yáng)性條帶，隨即對(duì)1號(hào)克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析(圖1-2.D)，并與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析，，結(jié)果顯示測(cè)序可信區(qū)域內(nèi)所涵蓋序列與標(biāo)準(zhǔn)序列的相似度為100%（圖1-2.E），據(jù)此確認(rèn)1號(hào)克隆質(zhì)粒為PAQR3-CD513的陽(yáng)性重組子，且序列正確。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 曾颯;秦曉東;何祥一;車(chē)春曉;張瀟;解斯羽;孫貴軍;王立鶴;;慢病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的人口腔黏膜上皮穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2016年05期

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本文編號(hào)：2710035