【摘要】：維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)是一種重要的水產(chǎn)病原菌,對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失,因此研制水產(chǎn)疫苗是必需的,由于其接種受限因素較多,開發(fā)新型口服疫苗并選擇合適抗原對水產(chǎn)疫苗的研制具有重要意義,麥芽糖孔蛋白作為一種特殊的外膜蛋白進行特異性結(jié)合,從而誘導(dǎo)機體釋放細胞因子,因此可以作為候選抗原應(yīng)用于基因口服疫苗的研究。本試驗通過克隆A.veronii TH0426株Malt基因,并構(gòu)建原核表達系統(tǒng)和細胞表面表達型重組干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)Lc-MCS-Malt和分泌表達型Lc-pPG-Malt,通過Western blotting驗證蛋白表達。結(jié)果顯示:經(jīng)過PCR能擴增得到1314 bp Malt基因片段,Western blotting條帶清晰,蛋白大小45 kDa;通過熒光顯微鏡可見明顯熒光信號的是Lc-MCS-Malt。為評估重組L.casei的免疫保護效果,本試驗以鯽魚作為試驗動物,將重組L.casei經(jīng)過乳糖誘導(dǎo)后混合海藻酸鈉包被顆粒飼料投喂鯽魚,在免疫前0 d、免疫后7、16、25和34 d采組織和血液,檢測免疫相關(guān)指標;檢測重組L.casei定植情況,單獨設(shè)定試驗組,連續(xù)投喂7 d,空腹28 d后無菌采集前、中和后腸,利用抗性平板進行計數(shù);攻毒檢測免疫保護率。采用ELISA方法檢測血清中IgM、ACP、AKP、SOD、IL-10、IL-1β、TNF-α、IFN-γ指標。結(jié)果表明:各項指標經(jīng)過口服免疫后都有所提升并差異明顯,通過口服免疫方式鯽魚能夠誘導(dǎo)鯽魚體液免疫分泌IgM和各項免疫指標;同時白細胞吞噬活性與分化能力都有所加強;利用qRT-PCR檢測各組織IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果表明:重組L.casei通過定植腸道刺激黏膜,使細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平呈上調(diào)趨勢,從而提升鯽魚免疫力,定植情況也表明經(jīng)過28 d的空腹,腸道內(nèi)仍存在重組L.casei,表明其定植能力良好;攻毒后觀察28 d,發(fā)現(xiàn)重組L.casei能有效緩解A.veronii造成的急性感染,在一定程度上起到保護作用。綜上所述,本試驗成功構(gòu)建2種不同表達類型的重組L.casei,Lc-MCS-Malt和Lc-pPG-Malt,經(jīng)過口服免疫的方式可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答,IgM含量上調(diào)并影響相關(guān)酶活性,同時促進白細胞分化和加強其吞噬活性,增強機體體液免疫應(yīng)答,各組織細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平也呈上調(diào)趨勢,重組L.casei能有效保護鯽魚并提高機體免疫力,試驗結(jié)果為水產(chǎn)口服乳酸菌疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

ASY-Malt 的鑒定挑取疑似陽性菌落置于液體果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測帶，且大小一致。圖 1-1 Malt 基因 PCR 擴增結(jié)L2000 DNA Maker；1-6 Malt 基g.1-1 The PCR amplification produA Marker；1-6: The PCR amplif

粒 pEASY-Malt 的鑒定平板上挑取疑似陽性菌落置于液體 LB 中培養(yǎng)，提，其結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖 1-2，質(zhì)目的條帶，，且大小一致。圖 1-1 Malt 基因 PCR 擴增結(jié)果M：DL2000 DNA Maker；1-6 Malt 基因 PCR 產(chǎn)物Fig.1-1 The PCR amplification product of Malt2000 DNA Marker；1-6: The PCR amplification product of M
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S941.42

【參考文獻】

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2 鄭宗林;鄭曙明;Delbert M.Gatlin Ⅲ;汪開毓;;嗜水氣單胞菌外膜蛋白ompA基因的原核表達及免疫保護性研究[J];淡水漁業(yè);2015年05期

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4 單曉楓;康元環(huán);夏京津;龍繼兵;陳龍;王惠;曹亮;孟慶峰;錢愛東;;不同動物源性維氏氣單胞菌生物學(xué)特性比較研究[J];中國獸醫(yī)雜志;2015年03期

5 曾范利;趙丹;康元環(huán);陳龍;王惠;單曉楓;錢愛東;;不同動物源性維氏氣單胞菌氣溶素基因的克隆及比較分析[J];中國獸藥雜志;2014年08期

6 趙敏;汪開毓;王均;陳德芳;黃凌遠;王浩丞;;斑點叉尾源維氏氣單胞菌對四環(huán)素類抗生素的耐藥性及耐藥基因的檢測[J];水生生物學(xué)報;2014年02期

7 孟慶峰;徐展;王偉利;;活載體疫苗的研究進展[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2013年19期

8 茍小蘭;王利;劉港彪;;齊口裂腹魚維氏氣單胞菌的耐藥性分析[J];西南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2013年05期

9 王海娟;王利;茍小蘭;龍鐘明;趙靜;;魚源維氏氣單胞菌的耐藥性研究[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年08期

10 馬蘇;高艷春;;動物源細菌耐藥性對動物細菌傳染性疾病防治的影響[J];中國獸藥雜志;2012年02期

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3 吳林怡;EGCG在草魚體內(nèi)的代謝及其對致病菌抑菌功效[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 葛錚;不同淡水魚類維氏氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 向楨;中藥有效成分對維氏氣單胞菌毒力基因表達的影響[D];西南大學(xué);2013年

6 宋雨澤;弧菌中整合接合元件的分子生物學(xué)特性研究[D];上海海洋大學(xué);2013年

7 范騰飛;氣單胞菌的毒力基因檢測及環(huán)境因子對毒力基因表達的影響[D];合肥工業(yè)大學(xué);2013年

8 夏飛;團頭魴源嗜水氣單胞菌分離鑒定、檢測及綠色熒光蛋白標記菌株的構(gòu)建[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

9 孟曉麗;STAg和霍亂毒素滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的弓形蟲特異性黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答[D];山西醫(yī)科大學(xué);2005年

本文編號：2709035