發(fā)布時間：2020-06-12 02:55

【摘要】：家蠶(Bombyx mori)作為一種具有重要經(jīng)濟價值的鱗翅目模式昆蟲,面臨著嚴(yán)重的疾病威脅。家蠶質(zhì)型多角體病毒(B.mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)是蠶業(yè)生產(chǎn)中常見的、危害十分嚴(yán)重的病原之一,引起家蠶中腸型膿病,降低蠶繭產(chǎn)量及繭絲質(zhì)量,最終給蠶業(yè)生產(chǎn)帶來極大的經(jīng)濟損失。本實驗室前期對感染BmCPV的家蠶cDNA模板進行轉(zhuǎn)錄組測序分析,在中腸篩選出多個抗性候選基因,其中包括家蠶肽聚糖識別蛋白S2(B.mori peptidoglycan recognition protein S2,BmPGRP-S2)和家蠶絲氨酸羧肽酶1(B.mori serine carboxypeptidase 1,BmSCP1)。在昆蟲的先天免疫防御中,PGRPs作為模式識別受體能激活Toll和Imd信號通路誘導(dǎo)下游抗菌肽基因的表達去幫助宿主抵抗外來微生物的入侵。中腸是家蠶重要的免疫器官,能夠分泌一些具有抗病毒活性的蛋白到腸液中,在感染初期抑制病毒的入侵。本論文將對BmPGRP-S2和BmSCP1的功能進行初步研究,并制備抗BmCPV轉(zhuǎn)基因家蠶素材,分別在調(diào)控宿主先天免疫防御和病毒感染初期抑制BmCPV的增殖。主要獲得以下的研究結(jié)果:1.增量表達BmPGRP-S2激活免疫通路提高家蠶對BmCPV的抗性基于基因組生物信息學(xué)和芯片數(shù)據(jù)分析,本研究從家蠶中腸中克隆得到BmPGRP-S2基因,多序列比對分析結(jié)果表明BmPGRP-S2蛋白不具備酰胺酶活性。構(gòu)建BmPGRP-S2增量表達載體,瞬時轉(zhuǎn)染BmE細(xì)胞,qPCR結(jié)果表明,增量表達BmPGRP-S2不會激活Toll和Imd信號通路。構(gòu)建BmPGRP-S2轉(zhuǎn)基因增量表達載體pb-PGRPS2,通過胚胎顯微注射獲得兩個轉(zhuǎn)基因品系PGRPS2-1和PGRPS2-2。qPCR和western blot結(jié)果顯示,BmPGRP-S2增量表達成功,且被分泌到細(xì)胞外�？剐詸z測結(jié)果顯示,當(dāng)四齡起蠶以3×10~5個/頭經(jīng)口食下感染BmCPV后,PGRPS2-1、PGRPS2-2和對照死亡率分別為12%、16%和48%,PGRPS2-1和PGRPS2-2的死亡率分別比對照降低了36%和32%。qPCR檢測感染后72 h家蠶體內(nèi)病毒含量,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因家蠶體內(nèi)的BmCPV含量顯著低于對照。主要經(jīng)濟性狀調(diào)查結(jié)果顯示,PGRPS2-1、PGRPS2-2和對照之間的全繭量和繭層率均沒有明顯區(qū)別。對未感染病毒家蠶的Toll和Imd通路基因進行qPCR檢測,結(jié)果顯示,與對照相比,PGRPS2-1中Toll和Imd通路基因均未發(fā)生顯著變化。感染病毒后,與對照相比,PGRPS2-1中Imd通路基因imd和relish被誘導(dǎo)上調(diào)表達,抗菌肽基因attacin2、gloverin2以及moricin基因的表達量升高,而Toll通路基因表達量無顯著變化。這些結(jié)果表明增量表達BmPGRP-S2可以通過激活I(lǐng)md通路誘導(dǎo)抗菌肽基因升高,有效提高家蠶的抗BmCPV能力,同時不會影響家蠶的經(jīng)濟性狀。2.增量表達BmSCP1在感染初期抑制BmCPV提高家蠶抗性基于基因組生物信息學(xué)和芯片數(shù)據(jù)分析,本研究從家蠶中腸中克隆得到BmSCP1基因,多序列比對分析發(fā)現(xiàn)BmSCP1具有絲氨酸蛋白酶的催化中心,認(rèn)為其是一個絲氨酸蛋白酶。構(gòu)建BmSCP1增量表達載體,瞬時轉(zhuǎn)染BmE細(xì)胞后,RT-PCR和western blot檢測結(jié)果表明,BmSCP1屬于分泌蛋白。而后,利用原核表達載體成功制備BmSCP1多克隆抗體。構(gòu)建BmSCP1轉(zhuǎn)基因增量表達載體pb-SCP1,通過胚胎顯微注射獲得兩個轉(zhuǎn)基因品系SCP1-1和SCP1-2。qPCR和western blot結(jié)果顯示,BmSCP1在轉(zhuǎn)基因家蠶中腸顯著升高,且轉(zhuǎn)基因家蠶腸液中BmSCP1含量明顯高于對照�？剐詸z測結(jié)果顯示,當(dāng)四齡起蠶以3×10~5個/頭經(jīng)口食下感染BmCPV后,SCP1-1、SCP1-2和對照死亡率分別為22%、27%和45%,SCP1-1和SCP1-2的死亡率分別比對照降低了23%和18%。qPCR檢測感染后72 h家蠶體內(nèi)病毒含量,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因家蠶體內(nèi)的BmCPV含量顯著低于對照。全繭量和繭層率調(diào)查結(jié)果顯示,表明增量表達BmSCP1不會影響家蠶的主要經(jīng)濟性狀。經(jīng)腸液處理后的病毒,最終以13×10~5個/頭的病毒濃度添食四齡起蠶,qPCR檢測感染后24 h家蠶體內(nèi)病毒含量,結(jié)果顯示,經(jīng)轉(zhuǎn)基因腸液處理后的病毒在家蠶體內(nèi)含量比對照更低,而用BmSCP抗體處理后的腸液使病毒在家蠶體內(nèi)含量比對照更高。這些結(jié)果表明,BmSCP1能夠在感染初期(腸液中)抑制病毒。
【圖文】：

1. 文獻綜述double-stranded RNA，dsRNA）介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)靶基因的 mRNA 發(fā)生特致相應(yīng)基因沉默的現(xiàn)象[47]。該現(xiàn)象首先在植物中發(fā)現(xiàn)，之后陸續(xù)在有報道[47, 48]。RNAi 是宿主免疫機制中一條重要的防御通路[49, 50]，種不同的模式：轉(zhuǎn)錄抑制模式和 RNAi 切割模式[51]。在轉(zhuǎn)錄抑制模A 進入細(xì)胞后被 Dicer-2 切割成 21-23nt 大小的小干擾 RNA（small inter，siRNA），隨后 siRNA 的一條鏈被整合進一種叫做 RNA 誘導(dǎo)的沉NA-induced silencing complex，RISC）中，最后 RISC 在 siRNA 的引 mRNA 結(jié)合，將該靶標(biāo) mRNA 降解。第二種模式是 RNAi 切割模侵為例，，病毒的 dsRNA 首先被細(xì)胞內(nèi)的 Dicer-2 識別，隨后被具有核ase III）活性的 Dicer-2 切割為 21 nt 大小的 siRNA。siRNA 與 RISC 一起裝配形成成熟的 RISC 復(fù)合體，在堿基互補配對原則的指導(dǎo)下A 被切割降解，從而抑制病毒復(fù)制。

圖 3.1 BmPGRP-S2 的序列分析Fig 3.1 The sequence analysis of BmPGRP-S2.劃線：信號肽；紅色字體：PGRP 結(jié)構(gòu)域；黃色方框：Ami_2 結(jié)構(gòu)域；*：終止密碼子derline, the signal peptide; red words, the PGRP domain; yellow box, the Ami_2 domain; asterisk, the don.3.2 BmPGRP-S2 不具備酰胺酶活性將 BmPGRP-S2 的氨基酸序列放入 NCBI 中進行 Blast 比對，選取典型的不酰胺酶活性的 PGRP（sDmPGRP-SA、HsPGRP-IαC）和具有酰胺酶活性的 PGRBmPGRP-S5、DmPGRP-SC1b）以及 T7 溶菌酶的氨基酸序列進行多序列對比，發(fā)現(xiàn) T7 噬菌體溶菌酶中的酰胺酶活性關(guān)鍵氨基酸半胱氨酸位點，在具備酶活性的 PGRPs 中同樣為半胱氨酸，在無酰胺酶活性的 PGRPs 中被絲氨酸代。BmPGRP-S2 的第 171 個氨基酸同樣被絲氨酸所取代。因此，BmPGRP具備酰胺酶活性。比對結(jié)果如圖 3.2 所示。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S884.5

【參考文獻】

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本文編號：2708903