【摘要】：杜氏鹽藻(Dunaliella sallina)是一種光自養(yǎng)單細(xì)胞、無纖維質(zhì)細(xì)胞壁的真核綠藻,能高水平合成β-胡蘿卜素和油脂,是生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素和優(yōu)質(zhì)生物燃料的良好原料。特別是鹽藻能在高鹽環(huán)境下正常生長,大規(guī)模養(yǎng)殖不易發(fā)生病蟲等污染,已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中一種重要的特用生物資源。構(gòu)建鹽藻高效遺傳轉(zhuǎn)化體系并對目標(biāo)基因進(jìn)行精準(zhǔn)修飾,可加快具突破性狀鹽藻優(yōu)異種質(zhì)的定向培育,促進(jìn)建立以遺傳改造的鹽藻工程株系為平臺生產(chǎn)高附加值特定化學(xué)品的綠色產(chǎn)業(yè)體系。為此,本研究以杜氏鹽藻YC-011藻株為受體,以參與三酰甘油(TAG)生物合成的兩個重要酶基因DGAT1a和GPAT為靶標(biāo),系統(tǒng)優(yōu)化電擊和基因槍遺傳轉(zhuǎn)化體系;分別將兩個外源靶基因?qū)臌}藻細(xì)胞并使其有效表達(dá),以期修飾藻細(xì)胞TAG合成途徑,進(jìn)而培育富油鹽藻優(yōu)異工程株系。主要研究結(jié)果如下:1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)和18SrDNA分子鑒定證實(shí)先期從山西運(yùn)城鹽湖分離獲得的鹽藻藻株YC-011 為杜氏鹽藻(Dunaliella sallina)一個新株系。2.應(yīng)用50μg/mL氯霉素、100μg/mL氨倫青霉素和100μg/mL頭孢霉素組合,經(jīng)3次除菌處理和5次繼代培養(yǎng),建立了杜氏鹽藻無菌培養(yǎng)體系。3.針對表達(dá)載體攜帶抗除草劑草銨膦篩選標(biāo)記(BAR基因),通過定量檢測鹽藻細(xì)胞對草銨膦的敏感性,確定固體和液體培養(yǎng)篩選陽性轉(zhuǎn)化體的草銨膦濃度分別為20 μg/mL和 40 μg/mL。4.建立了優(yōu)化的鹽藻電擊遺傳轉(zhuǎn)化體系:培養(yǎng)7天的鹽藻細(xì)胞為最適受體,質(zhì)粒濃度6μg/mL,電擊參數(shù)為0.4kv和4ms。鹽藻轉(zhuǎn)化率達(dá)2.63%。,比現(xiàn)有電擊轉(zhuǎn)化效率提高約1.14 倍。5.建立了優(yōu)化的鹽藻基因槍遺傳轉(zhuǎn)化體系:以培養(yǎng)7天的鹽藻細(xì)胞為受體,在靶距為6 cm、轟擊壓力為1300psi條件下進(jìn)行1次轟擊,轉(zhuǎn)化效率達(dá)0.13‰。6.來源于高油植物斑鳩菊(Vernonia galamensis)的VgDT1a cDNA克隆編碼催化TAG合成最后一步�；磻�(yīng)的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT1a)。來源于模式微藻萊菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CrGPAT cDNA克隆編碼甘油-3-磷酸�；D(zhuǎn)移酶(CrGPAT),它是磷脂酰甘油生物合成過程中的第一個�；セ浮１疚某晒�(gòu)建了分別表達(dá)CrGPAT和VgDGAAT1a的表達(dá)載體。7.GUS檢測和其他分子檢測顯示,靶基因VgDGAT1a和CrGPAT已成功轉(zhuǎn)入杜氏鹽藻受體細(xì)胞并高效表達(dá)。8.生理生化分析表明,野生型鹽藻油脂含量為15.3%,而轉(zhuǎn)VgDGAT1a和CrGPAT基因鹽藻油脂含量分別達(dá)36.9%和34.8%。可見,這兩個限速酶基因的超表達(dá)能提高藻細(xì)胞貯藏油脂的合成積累。特別是油脂含量提高,并未引起蛋白和類胡蘿卜素含量減低及其他不利表型。這些研究結(jié)果可應(yīng)用于微藻高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的研發(fā)、油脂等代謝途徑的基因修飾和可編程控制產(chǎn)物合成積累的新型微藻的遺傳構(gòu)建。
【圖文】：

生長均勻的鹽藻單藻落。取單藻落擴(kuò)繁培養(yǎng)，分別對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和１８ＳｒＤＮＡ分子鑒逡逑定。逡逑在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征（圖２．１）。該藻細(xì)胞的顏色為黃綠色，單細(xì)胞呈逡逑橢圓形或梨形，有一對鞭毛，細(xì)胞內(nèi)部有眼點(diǎn)，這是杜氏鹽藻的典型特征，可初步判定逡逑為綠藻門，，鹽藻屬，表明試驗(yàn)已經(jīng)獲得一株杜氏鹽藻系，命名為ＹＣ－０１１。逡逑＿逡逑圖２．１杜氏鹽藻藻株ＹＣ－０】１細(xì)胞形態(tài)逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋Ｄ．邋ｓａｌｉｎａ邋ＹＣ－０邋＼邋１邋ｓｔｒａｉｎ逡逑以所獲得的該鹽藻１８ＳｒＤＮＡ目標(biāo)序列為搜索序列，在ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行ＢＬＡＳＴ。逡逑選出其他藻種序列，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖２．２。逡逑－１４－逡逑

長至對數(shù)期的鹽藻液體培養(yǎng)基中。設(shè)置抗生素的濃度梯度為０、１００、２００、４００、６００、逡逑ＳＯＯｐｇ／ｍＬ，每個梯度設(shè)置６次重復(fù)。鹽藻對氯霉素很敏感，低濃度下即可抑制其生長逡逑（圖２．３），培養(yǎng)至第６天時，含有氯霉素２００邋ｎｇ／ｍＬ以ｈ的鹽藻藻液顏色發(fā)黃，藻細(xì)逡逑胞分解，細(xì)胞內(nèi)奔物流出。因此，必須選抒低濃度的Ｍy曀厴�？除雅P逶逡哄南婦８咤義嚇ǘ齲ǎ福埃板澹穡紓恚蹋┩鋒咼顧睪桶北逑�？妙欂覅①n曩諞種蒲臥逑赴ぃǜ螅玻矗澹玻擔(dān)�。辶x弦虼�，祱F(tuán)ǘ鵲穆讓顧睪透吲ǘ鵲耐鋒咼顧鼗虬避星嗝顧鼐捎糜詼攀涎臥宄嘌邋義舷�。辶x希掊危㈠澹懾澹澹у危澹翦澹義希村危海歟

本文編號：2708774