【摘要】：紫花苜蓿(Medicago sativa L.)作為畜牧業(yè)發(fā)展中極為重要的牧草。其具有蛋白質(zhì)含量富豐、適口性好等特點(diǎn),是豆科植物中營養(yǎng)價值最高的牧草。我國苜蓿草產(chǎn)量供不應(yīng)求,嚴(yán)重滯后了畜牧業(yè)的發(fā)展。干旱和鹽脅迫嚴(yán)重影響了植物的營養(yǎng)生長與生殖生長,我國西北及華北地區(qū)旱地及鹽堿土耕地所占面積比重較高。為了提高土地利用率以及減輕牧草與糧食作物間的競爭,利用分子育種手段培育抗旱耐鹽的紫花苜蓿新品種,對我國草產(chǎn)業(yè)及畜牧業(yè)的發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。本研究依據(jù)優(yōu)化了的紫花苜蓿高頻再生體系,將從旱生植物胡楊及鹽生植物秋茄中克隆的基因PeDREB2a::KcERF通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將其轉(zhuǎn)入受體材料紫花苜�！，F(xiàn)獲得結(jié)果如下:(1)選取中苜1號、中苜3號、甘農(nóng)4號作為植物材料;以葉片為外植體,通過篩選綜合3種植物材料得到優(yōu)化了的高頻再生體系:最優(yōu)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.2mg/L 6-BA+2 mg/L 2,4-D;最優(yōu)分化培養(yǎng)基為1/2MS+20g蔗糖;最優(yōu)生根培養(yǎng)基為1/2MS生根培養(yǎng)基+0.05mg/L IBA+0.05mg/L NAA。(2)經(jīng)篩選以中苜1號和甘農(nóng)4號作為受體材料,并以其葉片為外植體。依據(jù)優(yōu)化后的再生體系,通過根癌農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)將目的基因轉(zhuǎn)入受體材料。試驗得到轉(zhuǎn)基因抗性(Kan)株系:中苜1號66株,甘農(nóng)4號為27株。PCR檢測陽性率分別為93.94%、88.89%。(3)通過RT-PCR檢測證明轉(zhuǎn)基因陽性植株在反轉(zhuǎn)錄水平上能夠穩(wěn)定表達(dá);干旱脅迫及鹽脅迫下24h,轉(zhuǎn)基因株系中PeDREB2a、KcERF基因相對表達(dá)量在12h時最高;用20%PEG-3350和250mmol/LNaCl脅迫處理和生理指標(biāo)檢測,結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比抗旱耐鹽能力明顯增強(qiáng)。
【圖文】：

延伸 72°C 10min保存 12°C（3）瓊脂糖凝膠電泳：反應(yīng)結(jié)束后將 PCR 產(chǎn)物點(diǎn)樣至 1.5%的瓊脂糖凝中，110v，25min 進(jìn)行電泳檢測，以含有目的基因的質(zhì)粒為陽性對照，以野生DNA 為陰性對照。3.3 結(jié)果與分析3.3.1 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌 LBA4404 的 PCR 檢測將含有目的基因的質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌 LBA4404 中獲得單克隆進(jìn)行菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，同時以菌液為模板進(jìn)行 PCR。將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)1.5%瓊脂糖凝膠電泳（以 pCAMBIA2301-KcERF：：PeDREB2a 質(zhì)粒為陽性對照農(nóng)桿菌原菌為陰性對照）：

蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 轉(zhuǎn) PeDREB2a 和 KcERF 基因紫花苜蓿新材料的獲得與抗性分析行序列比對，，表明轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 LBA4404 的目的基因序列和理論序列一致，已經(jīng)將含有目的基因的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中。3.3.2 轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的獲得利用根癌農(nóng)桿菌侵染法將具有PeDREB2a和KcERF雙價基因的載體（圖3.2）轉(zhuǎn)化紫花苜蓿，并通過 Kan 篩選出多個轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿轉(zhuǎn)化苗，利用 PCR 技術(shù)對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測，以 35S 啟動子序列設(shè)計正向引物，目的基因序列設(shè)計反向引物。PCR 檢測時陽性對照為含有目的基因的質(zhì)粒，陰性對照為栽培品種基因組 DNA。通過 PCR 擴(kuò)增后，110v，25min 凝膠電泳檢測，拍照并統(tǒng)計結(jié)果。篩選出與陽性質(zhì)粒 PeDREB2a：：KcERF 具有相同大小目的條帶的紫花苜蓿植株。將檢測到的轉(zhuǎn) PeDREB2a 和 KcERF 基因植株從培養(yǎng)瓶中移栽到土盆里，為進(jìn)一步定植大田做準(zhǔn)備。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S541.9

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本文編號：2708610