發(fā)布時間：2020-06-11 21:57

【摘要】：縊蟶(Sinonovacula constricta)是我國重要的經濟貝類,具有良好的發(fā)展前景�？O蟶的養(yǎng)殖先在南方興起,而后由南到北發(fā)展,因其肉質鮮美,成為我國重要的經濟貝類。多巴胺受體作為神經系統(tǒng)中重要的神經遞質受體,為國內外學者所關注。多巴胺受體在感覺、運動、免疫、攝食、生長發(fā)育等生物學過程中都是重要的調節(jié)者和參與者。本研究通過RACE技術克隆得到縊蟶兩個多巴胺受體基因,分析了基因的序列特征和時空表達特征;通過抑制劑篩選實驗,基于多巴胺受體的藥理學特征鑒定出多巴胺受體類型,并篩選出適合縊蟶D2類多巴胺受體的抑制劑和作用濃度。探究了多巴胺受體在損傷修復中的作用,基于篩選出的抑制劑探究鰻弧菌感染之后的免疫應答反應,并檢測超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和過氧化氫酶(Catalase,CAT)的含量變化,初步探究了D2類受體在縊蟶幼蟲發(fā)育階段中的作用。具體的研究成果如下:1縊蟶多巴胺受體的克隆及其選擇性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)變異體從縊蟶轉錄組中得到兩個多巴胺受體的基因片段ScDopR1和ScDopR2,經過RACE克隆獲得兩個基因的cDNA全長,ScDopR2-1基因全長2216bp,包含5’UTR區(qū)171bp,ORF區(qū)1814bp,3’UTR區(qū)231bp,共編碼597個氨基酸殘基;ScDopR2-2基因發(fā)現兩個可變多聚腺苷酸化變異體,包含相同的ORF區(qū)和5’UTR區(qū),ORF區(qū)長1440bp,編碼479個氨基酸殘基,5’UTR區(qū)長34bp,兩個變異體的區(qū)別在于3’UTR區(qū)域的長短,ScDopR2-2b基因在polyA尾前比ScDopR2-2a基因多出了960bp,ScDopR2-2a變異體cDNA全長1824bp,ScDopR2-2b變異體cDNA全長2758bp�；蛐蛄刑卣鞯姆治龊凸δ苡虻念A測結果顯示,兩個受體均具備G蛋白偶聯受體的典型結構域,以及具有較長的第三胞內環(huán)以及較短的C-末端,基于D2類受體的結構特征,初步推測兩個多巴胺受體均為D2類多巴胺受體。2縊蟶多巴胺受體的時空表達特征分析利用熒光定量PCR檢測了多巴胺受體在縊蟶成體組織的表達情況,結果表明,兩個基因在斧足、肝、鰓、水管、唇瓣、外套膜、性腺中均有表達,ScDopR2-1在水管和唇瓣中的表達量最高,在斧足、鰓和外套膜中的表達量次之,在肝和性腺中的表達量最低。ScDopR2-2基因同源區(qū)段和ScDopR2-2b基因的表達模式基本相同,表達量最高的組織均為水管,在水管、鰓、斧足中的表達量顯著高于其他組織。ScDopR2-2基因同源區(qū)段與ScDopR2-2b相比,組織的表達量也存在差異性,ScDopR2-2基因同源區(qū)段的表達量在鰓中高于斧足,而ScDopR2-2b基因在鰓中的表達與斧足的大致相同。多巴胺受體在縊蟶早期發(fā)育階段的檢測結果表明,ScDopR2-1基因在匍匐期表達量最高,在D型期表達量次之,在這兩個時期出現兩個表達量峰值,呈現出先增加再減少再增加再減少的表達模式。而ScDopR2-2基因在殼頂期的表達量最高,從卵裂期、擔輪期、D型期表達量逐漸升高,到殼頂期表達量出現峰值,匍匐期又開始下降,匍匐期與稚貝期的表達量大致相同。3多巴胺受體抑制劑的篩選和多巴胺受體類型的驗證在抑制劑篩選實驗中,選取三種抑制劑多潘立酮(Domperidone,Domp)、舒必利(Sulpiride,Sulp)、鹽酸氯丙臻(Chlorprothixene hydrochloride,Chlo)作為受試物,以各自溶劑為對照組,選取2小時和6小時兩個時間點,通過檢測不同抑制劑作用濃度(10~(-2)M、10~(-3)M、10~(-5)M)下縊蟶血清中的cAMP含量,以及采用熒光定量檢測多巴胺受體基因的表達含量變化,對縊蟶多巴胺受體進行抑制劑種類和作用濃度的篩選。實驗結果表明,注射2小時和6小時兩個時間點,Chlo組的10~(-2)M的濃度下兩個時間點基因表達量與對照組相比均顯著下降,而cAMP也符合相比對照組上升的預期實驗效果。從而篩選得到多巴胺受體的合適抑制劑為Chlo,篩選出適合的作用濃度為10~(-2)M。根據已知的藥理學特征,抑制性配體刺激D2類受體的cAMP水平上升,進一步將多巴胺受體類型驗證為D2類多巴胺受體。4縊蟶水管損傷實驗和鰻弧菌感染實驗縊蟶水管損傷實驗,進水管損傷處理,不同時間點檢測多巴胺受體的表達量,結果表明在進水管損傷后,表達量在12h、48h時呈顯著上調,而在8h、24h、72h呈現顯著下調,暗示縊蟶多巴胺受體基因參與水管損傷后的反應過程,其結果上升-下調-上升的表達模式,推測與多巴胺的補償作用有關。鰻弧菌侵染實驗中,設置三個實驗組別:注射海水100ul(H組)、注射海水50ul+菌50ul(HJ組)、注射抑制劑50ul+菌50ul(CJ組),其中以H組為對照組。結果表明,ScDopR2-1基因在2h和4h的表達量上升,8h、12h、24h下降;三個實驗組別中,CJ組比HJ組和H組的表達量低,CJ組在4h、8h、12h表達量比H組顯著下降,而HJ組4h、8h比H組的表達量顯著下降。ScDopR2-2基因的表達量也在注射的2h、4h表達量升高,在8h、12h、24h表達量下降,三個實驗組別中,HJ組在2h和4h比H組顯著下降,CJ組比H組在8h顯著下降,CAT檢測結果表明,免疫反應啟動,抑制劑對免疫過程產生影響,多巴胺D2類受體參與調節(jié)免疫反應。5縊蟶多巴胺受體在早期發(fā)育中的作用利用受體抑制劑探究多巴胺受體在縊蟶早期發(fā)育中的作用,設置4種抑制劑作用濃度(10~(-2)M、10~(-3)M、、10~(-4)M、10~(-5)M),抑制劑處理縊蟶殼頂期幼蟲,24h后,計算幼蟲的長足率,結果表明,4種濃度抑制劑處理的幼蟲長足率分別為20%,35%,40%和40%,而空白組為60%,D2類多巴胺受體抑制劑起到了一定的抑制效果,推斷出多巴胺受體在縊蟶殼頂期幼蟲的發(fā)育中起到作用。
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體概述樞神經系統(tǒng)中重要的兒茶酚胺類神經遞質，結構式如是兒茶酚胺的組成之一，與去甲腎上腺素（Norepinehrine）一起構成兒茶酚胺，多巴胺在兒茶酚胺類神經遞的，是國內外學者對神經系統(tǒng)研究的重點。多巴胺的構，英文縮寫為 DA，具有一個鄰苯二酚結構（兒茶成（乙胺或其衍生物）[16]，多巴胺作為神經系統(tǒng)的重要意義也是廣泛的，在生物體的胚胎發(fā)育[17]、運動[3；18]、要的調控作用。多巴胺的合成與代謝在生物體內有著

上海海洋大學碩士學位論文體的結構與種類是屬于 G 蛋白偶聯受體家族，具有 7 次跨膜結構疏水的跨膜結構域（TM1-TM7），其間通過胞內環(huán)N 端和 C 端[33]，，三維結構圖如圖 1-2。多巴胺受體員，G 蛋白偶聯激酶是多巴胺受體重要的調節(jié)因的作用離不開 G 蛋白偶聯激酶的調節(jié)[34]。隨著第隆，人們對多巴胺受體的研究也進入了分子生物學
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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1 李琳;李磊;王慧麗;譚燕;吳曉鳳;劉銳;溫秀杰;劉暢;唐明;;多巴胺對脂多糖誘導小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應的影響[J];中華創(chuàng)傷雜志;2016年06期

2 楊亮;張紅星;崔英;周鋼橋;;可選擇性多聚腺苷酸化的生物學功能[J];軍事醫(yī)學;2015年05期

3 張慧杰;胡賢;;多巴胺受體基因功能多態(tài)性與人格[J];醫(yī)學綜述;2011年09期

4 唐勤;肖昱;劉s

本文編號：2708520