【摘要】：縊蟶(Sinonovacula constricta)是我國重要的經(jīng)濟(jì)貝類,具有良好的發(fā)展前景�？O蟶的養(yǎng)殖先在南方興起,而后由南到北發(fā)展,因其肉質(zhì)鮮美,成為我國重要的經(jīng)濟(jì)貝類。多巴胺受體作為神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)受體,為國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注。多巴胺受體在感覺、運(yùn)動(dòng)、免疫、攝食、生長發(fā)育等生物學(xué)過程中都是重要的調(diào)節(jié)者和參與者。本研究通過RACE技術(shù)克隆得到縊蟶兩個(gè)多巴胺受體基因,分析了基因的序列特征和時(shí)空表達(dá)特征;通過抑制劑篩選實(shí)驗(yàn),基于多巴胺受體的藥理學(xué)特征鑒定出多巴胺受體類型,并篩選出適合縊蟶D2類多巴胺受體的抑制劑和作用濃度。探究了多巴胺受體在損傷修復(fù)中的作用,基于篩選出的抑制劑探究鰻弧菌感染之后的免疫應(yīng)答反應(yīng),并檢測超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和過氧化氫酶(Catalase,CAT)的含量變化,初步探究了D2類受體在縊蟶幼蟲發(fā)育階段中的作用。具體的研究成果如下:1縊蟶多巴胺受體的克隆及其選擇性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)變異體從縊蟶轉(zhuǎn)錄組中得到兩個(gè)多巴胺受體的基因片段ScDopR1和ScDopR2,經(jīng)過RACE克隆獲得兩個(gè)基因的cDNA全長,ScDopR2-1基因全長2216bp,包含5’UTR區(qū)171bp,ORF區(qū)1814bp,3’UTR區(qū)231bp,共編碼597個(gè)氨基酸殘基;ScDopR2-2基因發(fā)現(xiàn)兩個(gè)可變多聚腺苷酸化變異體,包含相同的ORF區(qū)和5’UTR區(qū),ORF區(qū)長1440bp,編碼479個(gè)氨基酸殘基,5’UTR區(qū)長34bp,兩個(gè)變異體的區(qū)別在于3’UTR區(qū)域的長短,ScDopR2-2b基因在polyA尾前比ScDopR2-2a基因多出了960bp,ScDopR2-2a變異體cDNA全長1824bp,ScDopR2-2b變異體cDNA全長2758bp。基因序列特征的分析和功能域的預(yù)測結(jié)果顯示,兩個(gè)受體均具備G蛋白偶聯(lián)受體的典型結(jié)構(gòu)域,以及具有較長的第三胞內(nèi)環(huán)以及較短的C-末端,基于D2類受體的結(jié)構(gòu)特征,初步推測兩個(gè)多巴胺受體均為D2類多巴胺受體。2縊蟶多巴胺受體的時(shí)空表達(dá)特征分析利用熒光定量PCR檢測了多巴胺受體在縊蟶成體組織的表達(dá)情況,結(jié)果表明,兩個(gè)基因在斧足、肝、鰓、水管、唇瓣、外套膜、性腺中均有表達(dá),ScDopR2-1在水管和唇瓣中的表達(dá)量最高,在斧足、鰓和外套膜中的表達(dá)量次之,在肝和性腺中的表達(dá)量最低。ScDopR2-2基因同源區(qū)段和ScDopR2-2b基因的表達(dá)模式基本相同,表達(dá)量最高的組織均為水管,在水管、鰓、斧足中的表達(dá)量顯著高于其他組織。ScDopR2-2基因同源區(qū)段與ScDopR2-2b相比,組織的表達(dá)量也存在差異性,ScDopR2-2基因同源區(qū)段的表達(dá)量在鰓中高于斧足,而ScDopR2-2b基因在鰓中的表達(dá)與斧足的大致相同。多巴胺受體在縊蟶早期發(fā)育階段的檢測結(jié)果表明,ScDopR2-1基因在匍匐期表達(dá)量最高,在D型期表達(dá)量次之,在這兩個(gè)時(shí)期出現(xiàn)兩個(gè)表達(dá)量峰值,呈現(xiàn)出先增加再減少再增加再減少的表達(dá)模式。而ScDopR2-2基因在殼頂期的表達(dá)量最高,從卵裂期、擔(dān)輪期、D型期表達(dá)量逐漸升高,到殼頂期表達(dá)量出現(xiàn)峰值,匍匐期又開始下降,匍匐期與稚貝期的表達(dá)量大致相同。3多巴胺受體抑制劑的篩選和多巴胺受體類型的驗(yàn)證在抑制劑篩選實(shí)驗(yàn)中,選取三種抑制劑多潘立酮(Domperidone,Domp)、舒必利(Sulpiride,Sulp)、鹽酸氯丙臻(Chlorprothixene hydrochloride,Chlo)作為受試物,以各自溶劑為對(duì)照組,選取2小時(shí)和6小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),通過檢測不同抑制劑作用濃度(10~(-2)M、10~(-3)M、10~(-5)M)下縊蟶血清中的cAMP含量,以及采用熒光定量檢測多巴胺受體基因的表達(dá)含量變化,對(duì)縊蟶多巴胺受體進(jìn)行抑制劑種類和作用濃度的篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,注射2小時(shí)和6小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),Chlo組的10~(-2)M的濃度下兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著下降,而cAMP也符合相比對(duì)照組上升的預(yù)期實(shí)驗(yàn)效果。從而篩選得到多巴胺受體的合適抑制劑為Chlo,篩選出適合的作用濃度為10~(-2)M。根據(jù)已知的藥理學(xué)特征,抑制性配體刺激D2類受體的cAMP水平上升,進(jìn)一步將多巴胺受體類型驗(yàn)證為D2類多巴胺受體。4縊蟶水管損傷實(shí)驗(yàn)和鰻弧菌感染實(shí)驗(yàn)縊蟶水管損傷實(shí)驗(yàn),進(jìn)水管損傷處理,不同時(shí)間點(diǎn)檢測多巴胺受體的表達(dá)量,結(jié)果表明在進(jìn)水管損傷后,表達(dá)量在12h、48h時(shí)呈顯著上調(diào),而在8h、24h、72h呈現(xiàn)顯著下調(diào),暗示縊蟶多巴胺受體基因參與水管損傷后的反應(yīng)過程,其結(jié)果上升-下調(diào)-上升的表達(dá)模式,推測與多巴胺的補(bǔ)償作用有關(guān)。鰻弧菌侵染實(shí)驗(yàn)中,設(shè)置三個(gè)實(shí)驗(yàn)組別:注射海水100ul(H組)、注射海水50ul+菌50ul(HJ組)、注射抑制劑50ul+菌50ul(CJ組),其中以H組為對(duì)照組。結(jié)果表明,ScDopR2-1基因在2h和4h的表達(dá)量上升,8h、12h、24h下降;三個(gè)實(shí)驗(yàn)組別中,CJ組比HJ組和H組的表達(dá)量低,CJ組在4h、8h、12h表達(dá)量比H組顯著下降,而HJ組4h、8h比H組的表達(dá)量顯著下降。ScDopR2-2基因的表達(dá)量也在注射的2h、4h表達(dá)量升高,在8h、12h、24h表達(dá)量下降,三個(gè)實(shí)驗(yàn)組別中,HJ組在2h和4h比H組顯著下降,CJ組比H組在8h顯著下降,CAT檢測結(jié)果表明,免疫反應(yīng)啟動(dòng),抑制劑對(duì)免疫過程產(chǎn)生影響,多巴胺D2類受體參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。5縊蟶多巴胺受體在早期發(fā)育中的作用利用受體抑制劑探究多巴胺受體在縊蟶早期發(fā)育中的作用,設(shè)置4種抑制劑作用濃度(10~(-2)M、10~(-3)M、、10~(-4)M、10~(-5)M),抑制劑處理縊蟶殼頂期幼蟲,24h后,計(jì)算幼蟲的長足率,結(jié)果表明,4種濃度抑制劑處理的幼蟲長足率分別為20%,35%,40%和40%,而空白組為60%,D2類多巴胺受體抑制劑起到了一定的抑制效果,推斷出多巴胺受體在縊蟶殼頂期幼蟲的發(fā)育中起到作用。
【圖文】：

體概述樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，結(jié)構(gòu)式如是兒茶酚胺的組成之一，與去甲腎上腺素（Norepinehrine）一起構(gòu)成兒茶酚胺，多巴胺在兒茶酚胺類神經(jīng)遞的，是國內(nèi)外學(xué)者對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)研究的重點(diǎn)。多巴胺的構(gòu)，英文縮寫為 DA，具有一個(gè)鄰苯二酚結(jié)構(gòu)（兒茶成（乙胺或其衍生物）[16]，多巴胺作為神經(jīng)系統(tǒng)的重要意義也是廣泛的，在生物體的胚胎發(fā)育[17]、運(yùn)動(dòng)[3；18]、要的調(diào)控作用。多巴胺的合成與代謝在生物體內(nèi)有著

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文體的結(jié)構(gòu)與種類是屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體家族，具有 7 次跨膜結(jié)構(gòu)疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域（TM1-TM7），其間通過胞內(nèi)環(huán)N 端和 C 端[33]，，三維結(jié)構(gòu)圖如圖 1-2。多巴胺受體員，G 蛋白偶聯(lián)激酶是多巴胺受體重要的調(diào)節(jié)因的作用離不開 G 蛋白偶聯(lián)激酶的調(diào)節(jié)[34]。隨著第隆，人們對(duì)多巴胺受體的研究也進(jìn)入了分子生物學(xué)
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 李琳;李磊;王慧麗;譚燕;吳曉鳳;劉銳;溫秀杰;劉暢;唐明;;多巴胺對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響[J];中華創(chuàng)傷雜志;2016年06期

2 楊亮;張紅星;崔英;周鋼橋;;可選擇性多聚腺苷酸化的生物學(xué)功能[J];軍事醫(yī)學(xué);2015年05期

3 張慧杰;胡賢;;多巴胺受體基因功能多態(tài)性與人格[J];醫(yī)學(xué)綜述;2011年09期

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本文編號(hào)：2708520