【摘要】：目的:研究mi RNA芯片數(shù)據(jù)庫中腎透明細胞癌(cc RCC)組織與癌旁正常組織中mi RNA表達譜的差異,分析mi R-514a-3p在cc RCC組織中的表達情況與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。方法:利用在線mi RNA芯片數(shù)據(jù)庫ym500v2中的芯片數(shù)據(jù)分析496例cc RCC原發(fā)腫瘤組織和71例癌旁正常組織中mi RNA表達譜的差異,將fold change3且p0.05設(shè)定為顯著表達差異;利用實時q RT-PCR法檢測20對cc RCC臨床組織標本和四種腎癌細胞系中mi R-514a-3p的表達情況;利用獨立樣本t檢驗分析揭示mi R-514a-3p的表達變化與cc RCC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果:mi RNA表達譜分析共發(fā)現(xiàn)54個mi RNAs在cc RCC組織與癌旁正常組織中存在表達差異,其中27個在腎癌組織中表達顯著上調(diào),另外27個顯著下調(diào);q RT-PCR結(jié)果顯示:相比癌旁正常組織或正常腎小管上皮細胞,cc RCC組織或腎癌細胞系中mi R-514a-3p的表達均顯著下調(diào)(所有p0.01);t檢驗分析顯示cc RCC組織中mi R-514a-3p的表達變化與臨床病理參數(shù)之間無顯著相關(guān)性(所有p0.05)。結(jié)論:cc RCC組織與癌旁正常組織的mi RNA表達譜具有顯著差異,其中以mi R-514a-3p下調(diào)最顯著,另外mi R-514a-3p在腎癌細胞系中也是顯著下調(diào)的,然而mi R-514a-3p的表達變化與臨床病理參數(shù)之間無顯著相關(guān)性;mi R-514a-3p在cc RCC中有可能扮演抑癌基因的角色。目的:證實腎透明細胞癌(cc RCC)中mi R-514a-3p對靶基因的靶向調(diào)控作用及機制。方法:利用在線mi RNA靶基因預(yù)測軟件篩選出mi R-514a-3p的潛在靶基因;利用實時q RT-PCR檢測靶基因m RNA的表達和相關(guān)性分析揭示mi R-514a-3p與靶基因表達的相關(guān)性;將化學(xué)合成的模擬物mi R-514a-3p mimic及抑制劑mi R-514a-3p inhibitor均分別轉(zhuǎn)染到腎癌細胞系中,應(yīng)用實時q RT-PCR和Western blot檢測靶基因m RNA和蛋白的表達變化;構(gòu)建含靶基因3′-UTR野生型或突變型的雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒載體,利用雙熒光素酶法檢測分析mi R-514a-3p對靶基因的調(diào)控方式。結(jié)果:在線mi RNA靶基因預(yù)測軟件篩選出EGFR作為mi R-514a-3p的潛在靶基因。實時q RT-PCR結(jié)果顯示EGFR m RNA在腎癌組織中的表達顯著高于癌旁組織(p0.0001),且相關(guān)性分析揭示EGFR的表達與mi R-514a-3p呈顯著負相關(guān)(p0.05)。相比轉(zhuǎn)染mimic NC或inhibitor NC,轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p mimic或mi R-514a-3p inhibitor后腎癌細胞中EGFR m RNA無顯著變化(所有p0.05),但是轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p mimic后腎癌細胞中蛋白質(zhì)均顯著下調(diào),反之轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p inhibitor后EGFR蛋白質(zhì)表達顯著上調(diào)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示,在轉(zhuǎn)入mi R-514a-3p mimic后,腎癌細胞中野生型EGFR 3′-UTR的熒光素酶活性較對照組明顯降低(所有p0.01),而突變型EGFR 3′-UTR無顯著影響(所有p0.05),反之,在轉(zhuǎn)入mi R-514a-3p inhibitor后,腎癌細胞中野生型EGFR 3′-UTR的熒光素酶活性較對照組明顯升高(所有p0.05),而突變型EGFR 3′-UTR無明顯改變(所有p0.05)。結(jié)論:在cc RCC組織中,EGFR的表達比癌旁組織顯著升高,且與mi R-514a-3p的表達呈負相關(guān);mi R-514a-3p在轉(zhuǎn)錄后水平抑制EGFR的翻譯,而不是使其裂解;mi R-514a-3p直接靶向調(diào)控EGFR的表達。目的:探討mi R-514a-3p和EGFR對腎癌細胞生物學(xué)行為的影響及其機制。方法:將化學(xué)合成的小分子抑制劑si-EGFR轉(zhuǎn)染到腎癌細胞,利用集落形成實驗及侵襲遷移實驗檢測EGFR對腎癌細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響;將化學(xué)合成的mi R-514a-3p mimic及mi R-514a-3p inhibitor均分別轉(zhuǎn)染到腎癌細胞中,利用MTS法、集落形成實驗及侵襲遷移實驗觀察腎癌細胞的活力、增殖、侵襲和遷移能力的變化;建立裸鼠腎癌荷瘤模型,定期將化學(xué)合成的模擬物mi R-514a-3p agomir或?qū)φ兆⑸涞侥[瘤內(nèi),觀察腫瘤生長的變化;利用Western blot檢測EGFR下游關(guān)鍵信號通路分子表達的變化。結(jié)果:相比對照組,轉(zhuǎn)染si-EGFR后腎癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力均顯著降低(所有p0.05);轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p inhibitor后腎癌細胞的活力、增殖能力、侵襲及遷移能力均比對照組顯著升高(所有p0.05),反之,轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p mimic后腎癌細胞的活力、增殖能力、侵襲及遷移能力均顯著降低(所有p0.05);體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,注射mi R-514a-3p agomir后裸鼠皮下移植瘤的體積和重量顯著小于對照組(所有p0.01);Western blot結(jié)果顯示:相比對照組,轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p mimic或inhibitor后,腎癌細胞中AKT、p-AKT及ERK 1/2的表達與對照組均無顯著差異,而p-ERK1/2的表達與對照組之間有顯著差異,其中轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p mimic后腎癌細胞中p-ERK1/2的表達比對照組均顯著下調(diào),反之,轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p inhibitor后腎癌細胞中p-ERK1/2的表達均顯著高于對照組。結(jié)論:EGFR可促進腎癌細胞的增殖、侵襲和遷移,而mi R-514a-3p可通過EGFR抑制腎癌細胞的活力、增殖、侵襲及遷移能力;mi R-514a-3p可抑制裸鼠皮下移植瘤的生長;mi R-514a-3p是通過EGFR/MAPK/ERK通路而不是EGFR/PI3K/AKT通路抑制腎癌的增殖、侵襲和遷移。
【圖文】：

ccRCC組織中顯著表達差異的miRNAs

腎透明細胞癌與癌旁正常組織
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.11

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本文編號：2707813