【摘要】：目的:研究mi RNA芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中腎透明細(xì)胞癌(cc RCC)組織與癌旁正常組織中mi RNA表達(dá)譜的差異,分析mi R-514a-3p在cc RCC組織中的表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。方法:利用在線mi RNA芯片數(shù)據(jù)庫(kù)ym500v2中的芯片數(shù)據(jù)分析496例cc RCC原發(fā)腫瘤組織和71例癌旁正常組織中mi RNA表達(dá)譜的差異,將fold change3且p0.05設(shè)定為顯著表達(dá)差異;利用實(shí)時(shí)q RT-PCR法檢測(cè)20對(duì)cc RCC臨床組織標(biāo)本和四種腎癌細(xì)胞系中mi R-514a-3p的表達(dá)情況;利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析揭示mi R-514a-3p的表達(dá)變化與cc RCC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果:mi RNA表達(dá)譜分析共發(fā)現(xiàn)54個(gè)mi RNAs在cc RCC組織與癌旁正常組織中存在表達(dá)差異,其中27個(gè)在腎癌組織中表達(dá)顯著上調(diào),另外27個(gè)顯著下調(diào);q RT-PCR結(jié)果顯示:相比癌旁正常組織或正常腎小管上皮細(xì)胞,cc RCC組織或腎癌細(xì)胞系中mi R-514a-3p的表達(dá)均顯著下調(diào)(所有p0.01);t檢驗(yàn)分析顯示cc RCC組織中mi R-514a-3p的表達(dá)變化與臨床病理參數(shù)之間無(wú)顯著相關(guān)性(所有p0.05)。結(jié)論:cc RCC組織與癌旁正常組織的mi RNA表達(dá)譜具有顯著差異,其中以mi R-514a-3p下調(diào)最顯著,另外mi R-514a-3p在腎癌細(xì)胞系中也是顯著下調(diào)的,然而mi R-514a-3p的表達(dá)變化與臨床病理參數(shù)之間無(wú)顯著相關(guān)性;mi R-514a-3p在cc RCC中有可能扮演抑癌基因的角色。目的:證實(shí)腎透明細(xì)胞癌(cc RCC)中mi R-514a-3p對(duì)靶基因的靶向調(diào)控作用及機(jī)制。方法:利用在線mi RNA靶基因預(yù)測(cè)軟件篩選出mi R-514a-3p的潛在靶基因;利用實(shí)時(shí)q RT-PCR檢測(cè)靶基因m RNA的表達(dá)和相關(guān)性分析揭示mi R-514a-3p與靶基因表達(dá)的相關(guān)性;將化學(xué)合成的模擬物mi R-514a-3p mimic及抑制劑mi R-514a-3p inhibitor均分別轉(zhuǎn)染到腎癌細(xì)胞系中,應(yīng)用實(shí)時(shí)q RT-PCR和Western blot檢測(cè)靶基因m RNA和蛋白的表達(dá)變化;構(gòu)建含靶基因3′-UTR野生型或突變型的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體,利用雙熒光素酶法檢測(cè)分析mi R-514a-3p對(duì)靶基因的調(diào)控方式。結(jié)果:在線mi RNA靶基因預(yù)測(cè)軟件篩選出EGFR作為mi R-514a-3p的潛在靶基因。實(shí)時(shí)q RT-PCR結(jié)果顯示EGFR m RNA在腎癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(p0.0001),且相關(guān)性分析揭示EGFR的表達(dá)與mi R-514a-3p呈顯著負(fù)相關(guān)(p0.05)。相比轉(zhuǎn)染mimic NC或inhibitor NC,轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p mimic或mi R-514a-3p inhibitor后腎癌細(xì)胞中EGFR m RNA無(wú)顯著變化(所有p0.05),但是轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p mimic后腎癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)均顯著下調(diào),反之轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p inhibitor后EGFR蛋白質(zhì)表達(dá)顯著上調(diào)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,在轉(zhuǎn)入mi R-514a-3p mimic后,腎癌細(xì)胞中野生型EGFR 3′-UTR的熒光素酶活性較對(duì)照組明顯降低(所有p0.01),而突變型EGFR 3′-UTR無(wú)顯著影響(所有p0.05),反之,在轉(zhuǎn)入mi R-514a-3p inhibitor后,腎癌細(xì)胞中野生型EGFR 3′-UTR的熒光素酶活性較對(duì)照組明顯升高(所有p0.05),而突變型EGFR 3′-UTR無(wú)明顯改變(所有p0.05)。結(jié)論:在cc RCC組織中,EGFR的表達(dá)比癌旁組織顯著升高,且與mi R-514a-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān);mi R-514a-3p在轉(zhuǎn)錄后水平抑制EGFR的翻譯,而不是使其裂解;mi R-514a-3p直接靶向調(diào)控EGFR的表達(dá)。目的:探討mi R-514a-3p和EGFR對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制。方法:將化學(xué)合成的小分子抑制劑si-EGFR轉(zhuǎn)染到腎癌細(xì)胞,利用集落形成實(shí)驗(yàn)及侵襲遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EGFR對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的影響;將化學(xué)合成的mi R-514a-3p mimic及mi R-514a-3p inhibitor均分別轉(zhuǎn)染到腎癌細(xì)胞中,利用MTS法、集落形成實(shí)驗(yàn)及侵襲遷移實(shí)驗(yàn)觀察腎癌細(xì)胞的活力、增殖、侵襲和遷移能力的變化;建立裸鼠腎癌荷瘤模型,定期將化學(xué)合成的模擬物mi R-514a-3p agomir或?qū)φ兆⑸涞侥[瘤內(nèi),觀察腫瘤生長(zhǎng)的變化;利用Western blot檢測(cè)EGFR下游關(guān)鍵信號(hào)通路分子表達(dá)的變化。結(jié)果:相比對(duì)照組,轉(zhuǎn)染si-EGFR后腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力均顯著降低(所有p0.05);轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p inhibitor后腎癌細(xì)胞的活力、增殖能力、侵襲及遷移能力均比對(duì)照組顯著升高(所有p0.05),反之,轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p mimic后腎癌細(xì)胞的活力、增殖能力、侵襲及遷移能力均顯著降低(所有p0.05);體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,注射mi R-514a-3p agomir后裸鼠皮下移植瘤的體積和重量顯著小于對(duì)照組(所有p0.01);Western blot結(jié)果顯示:相比對(duì)照組,轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p mimic或inhibitor后,腎癌細(xì)胞中AKT、p-AKT及ERK 1/2的表達(dá)與對(duì)照組均無(wú)顯著差異,而p-ERK1/2的表達(dá)與對(duì)照組之間有顯著差異,其中轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p mimic后腎癌細(xì)胞中p-ERK1/2的表達(dá)比對(duì)照組均顯著下調(diào),反之,轉(zhuǎn)染mi R-514a-3p inhibitor后腎癌細(xì)胞中p-ERK1/2的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組。結(jié)論:EGFR可促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,而mi R-514a-3p可通過(guò)EGFR抑制腎癌細(xì)胞的活力、增殖、侵襲及遷移能力;mi R-514a-3p可抑制裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng);mi R-514a-3p是通過(guò)EGFR/MAPK/ERK通路而不是EGFR/PI3K/AKT通路抑制腎癌的增殖、侵襲和遷移。
【圖文】：

ccRCC組織中顯著表達(dá)差異的miRNAs

腎透明細(xì)胞癌與癌旁正常組織
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.11

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本文編號(hào)：2707813