【摘要】：在生殖過程中,卵黃原蛋白作為卵黃前體,是卵生生物包括昆蟲中非常重要的。卵黃原蛋白的轉錄通常是由激素調控的,比如保幼激素、蛻皮激素及某些神經肽。關于昆蟲卵黃原蛋白的轉錄調控研究主要集中在雙翅目與鱗翅目,膜翅目昆蟲的卵黃原蛋白轉錄調控研究較少。蘭州熊蜂作為一種重要的授粉昆蟲,擴大其繁殖量,產生更多的工蜂后代可更好地滿足實際應用中授粉的需求。基于此,研究蘭州熊蜂的轉錄調控具有十分重要的意義。主要結果如下:1、蘭州熊蜂卵黃原蛋白基因結構及表達特性蘭州熊蜂卵黃原蛋白基因(Genbank號:MF632304)全長為7227bp,包含7個外顯子和6個內含子,其mRNA(Genbank號:MF632303)序列長度為5319bp,編碼的蛋白長度為1772個氨基酸、分子量201.5 kDa及等電點為6.21。對蘭州熊蜂的卵黃原蛋白(BlVg)進行保守域分析,發(fā)現(xiàn)其具有典型的卵黃原蛋白結構域:第一,在N端附近的Vitellogenin_N保守域從第28個氨基酸開始,到第750個氨基酸終止;第二,中間部位有保守域DUF1943,自第783個氨基酸起至第1043氨基酸;第三,在C端第1450個氨基酸至第1620個氨基酸為保守域VWD。通過系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn),其與其他熊蜂物種位于一個分支上。分別取處女蜂王及產卵蜂王的頭、飛行肌、卵巢與脂肪體組織,采用實時熒光定量PCR方法檢測BlVg的mRNA表達量。qRT-PCR結果顯示,相同生殖狀態(tài)下的蜂王,在脂肪體中表達量最高(處女王為383.9-倍;產卵蜂王為3357.07倍),飛行肌、頭次之,卵巢最低,且不同組織之間均存在顯著性差異(p0.05)。在相同組織中,產卵蜂王的BlVg的mRNA表達量顯著高于處女蜂王(p0.05)。2、蘭州熊蜂轉錄因子Broad-Complex基因的特征及真核表達蘭州熊蜂Broad-Complex基因選擇性剪切體眾多,通過PCR獲得Z1-Z4這四種剪切體,分別命名為BlBrC-Z1、2、BlBrC-Z3和BlBrC-Z4,它們的核苷酸長度分別為1491 bp、1293 bp、1257 bp與1239 bp。蘭州熊蜂B1BrC蛋白具有典型的Broad-Complex蛋白應有的保守域:第一,在N端附近的中心區(qū)域由BTB保守域及Linker組成;第二,在C端為各種選擇性剪切體特異的鋅指結構域。通過與蘭州熊蜂基因組數據(未發(fā)表)比對,發(fā)現(xiàn)這四種剪切體在DNA上的排列順序為Z4、Z3、Z2、Z1。通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn),與處女蜂王相比,產卵蜂王的卵巢中BlBrC-Z1與BlBrC-Z3表達量顯著升高。將這四種剪切體構建至pBmFlag-B1BrC重組質粒進行真核表達。通過Western blot證明這四個蛋白均成功表達。3、蘭州熊蜂卵黃原蛋白基因BlVg啟動子的活性分析采用染色體步移法,以蘭州熊蜂腹部DNA為模板,獲得卵黃原蛋白基因BlVg起始密碼子上游1517 bp長度的5'側翼序列。生物信息學分析顯示,該序列具有TATAbox、CAATbox、C/EBP等基本元件和DBrC3、DE74等響應蛻皮激素信號的重要結合元件。隨后構建不同長度的啟動子缺失片段,最后利用瞬時轉染技術分析該基因啟動子的轉錄活性及調控應答激素的相關元件。結果顯示,保幼激素誘導沒有顯著改變BlVg啟動子的活性,而20-羥基蛻皮酮對BlVg啟動子活性具有明顯的誘導作用。4、轉錄因子Broad-Complex對BlVg啟動子活性的調控作用運用點突變技術,發(fā)現(xiàn)啟動子上DBrC3結合位點堿基的突變會導致其不能被20-羥基蛻皮酮誘導;此外,將轉錄因子Broad-Complex與BlVg啟動子共轉染至Sf9細胞,檢測啟動子的熒光素酶活性,發(fā)現(xiàn)只有BlBrC-Z3轉錄因子可以提高啟動子活性。
【圖文】：

蜂的生殖方式逡逑蜂的生殖方式包括兩性生殖和孤雌生殖。雖由受精卵發(fā)育而來的雌性蜂，但只有蜂王具有產受精卵和未受精卵；而工蜂的生殖系統(tǒng)發(fā)，只能產生未受精卵；雄蜂是由未受精卵發(fā)熊蜂蜂王產卵的因素逡逑然界的熊蜂蜂群繁育類似，在人工繁育中，蜂越冬或人工滯育的蜂王。因此，越冬蜂王的卵的發(fā)展起決定性作用。卵巢發(fā)育快的蜂王通常蜂出房也較早，因而，蜂群能夠快速擴大。因蜂王產卵的因素達到理想的人工繁育規(guī)模。逡逑

有凝膠阻滯分析、ＤＮａｓｅｌ足跡實驗和酵母單雜交分析。逡逑凝膠阻滯分析即電泳遷移率變動分析（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ逡逑ＭｏｂｉｌｉｔｙＳｈｉｆｔＡｓｓａｙ，ＥＭＳＡ），其作用原理如圖１．２所示。具體原逡逑理如下：蛋白質與末端標記的核酸探針相結合可形成復合物，這逡逑種復合物在電泳時比無蛋白結合的探針泳動的速度慢，即條帶位逡逑置相對滯后。該法操作簡單、實驗過程快速、反應靈敏，，使其已逡逑成為研究啟動子轉錄調控的一項重要方法。Ｋａｙｕｋａｗａ等利用該法逡逑證實家蠶保幼激素ＪＨ誘導的Ｋｒ－ｈｌ直接結合在Ｅ９３啟動子上游的逡逑ＫＢＳ位點從而抑制Ｅ９３的轉錄［４７］0Ｚｈａｎｇ與Ｚｈｅｎｇ通過該法證明逡逑家蠶的幾丁質酶５基因的啟動子上含有ＢＲ－Ｃ邋Ｚ４順式調控元件逡逑［４８］。Ｎｉｓｈｉｔａ采用ＥＭＳＡ法發(fā)現(xiàn)ＥｃＲ／Ｕｓｐ可與ＢｍＢＲ－Ｃ啟動子上逡逑的ＥｃＲＥ－Ｄｂ序列結合［４９］．逡逑白慰是取物逡逑二■取蛋白彶與ｓ敵結合逡逑／逡逑凝寂電泳邐逡逑Ｉ邐鼻——合物逡逑ｆ—Ｔ—逡逑放射自顯影逡逑：｜邐邐ｊ邐滯后逡逑１邐邐邋ｆ￣￣￣白結含逡逑ｉｉ—ｉｉｎｉ邐Ｉ逡逑圖１．２凝膠阻滯實驗原理圖逡逑Ｆｉｇ．１．２邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＥＭＳＡ逡逑ＤＮａｓｅｌ足跡實驗，可用來檢測被特定的轉錄因子結合的ＤＮＡ逡逑序列所在位置及其核苷酸序列結構。基本原理是當ＤＮＡ分子中的逡逑某一區(qū)段與特異的轉錄因子結合之后便可得到保護而免受ＤＮａｓｅｌ逡逑酶的切割作用，結果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現(xiàn)了一逡逑個空白區(qū)，俗稱為“足跡”。該方法不僅能找到與特異ＤＮＡ結合逡逑的目標蛋白
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：博士后
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S891

【參考文獻】

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本文編號：2703107