【摘要】：目的:在中國,胃癌的死亡率很高,僅次于肺癌,是死亡率排名第二的腫瘤。隨著胃癌的早期診斷和治療手段的不斷進(jìn)展,其發(fā)病率在發(fā)展中國家有所下降,但與其他惡性腫瘤相比,其總體預(yù)后仍然不佳。胃癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是胃癌死亡率居高不下的最主要的原因之一。那么,提高胃癌的早期診斷和晚期胃癌的藥物治療的開發(fā)尤為重要。因此,我們需要尋找影響胃癌發(fā)展的分子標(biāo)志物,并進(jìn)一步研究影響胃癌發(fā)展的分子機(jī)制及信號(hào)通路,減少胃癌的死亡率。SIX1屬于同源盒基因SIX家族中的一員,廣泛存在于從低等無脊椎動(dòng)物到人類等許多物種中。SIX1參與到許多組織和器官的發(fā)育當(dāng)中,作為一個(gè)人體發(fā)育的主要的調(diào)節(jié)因子,是正常發(fā)育必不可少的。作為轉(zhuǎn)錄因子,SIX1蛋白能夠調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展,還能促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移,并且抑制細(xì)胞凋亡。最近的研究表明,SIX1參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,是一個(gè)重要的癌基因,并且與一些腫瘤的預(yù)后具有相關(guān)性。MicroRNAs(miRNAs)是一類新的內(nèi)源性非編碼的小RNA,大量研究表明miRNA的異常調(diào)控在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,包括胃癌在內(nèi)。miRNA可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程。miR-429是參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的眾多miRNA中的一種。miR-429能夠抑制某些腫瘤的生長和侵襲,包括肝癌和前列腺癌。然而,miR-429在人類胃癌中的表達(dá)模式如何及其在胃癌發(fā)展過程中到底發(fā)揮著怎樣的作用,目前仍然是未知的。本課題通過檢測(cè)胃癌組織及癌周正常組織中SIX1的表達(dá),探討其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性;通過分析細(xì)胞周期以及細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白質(zhì),探討SIX1影響胃癌細(xì)胞增殖及侵襲所依賴的分子機(jī)制;并通過檢測(cè)miR-429在胃癌組織及癌周正常組織中的表達(dá)情況及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響,分析miR-429的生物學(xué)行為以及其潛在的分子機(jī)制。方法:本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)208例胃癌及癌旁正常組織中SIX1的表達(dá)情況。通過RT-PCR以及Western blot法檢測(cè)胃癌細(xì)胞中SIX1基因mRNA及蛋白表達(dá)水平;通過細(xì)胞生長曲線檢測(cè)SIX1對(duì)胃癌細(xì)胞生長與增殖的作用,用基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SIX1對(duì)細(xì)胞侵襲的作用。應(yīng)用Western blot檢測(cè)SIX1與其他蛋白相互間的作用。同時(shí),我們通過RT-qPCR檢測(cè)miR-429在胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)水平,通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-429對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響;用基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-429對(duì)細(xì)胞侵襲的作用,應(yīng)用Western blot檢測(cè)miR-429與其他蛋白相互間的作用。我們還構(gòu)建了miRNA靶基因報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng),驗(yàn)證SIX1是否為miR-429直接作用的靶基因。結(jié)果:1、SIX1在胃癌組織中過表達(dá):免疫組化顯示SIX1蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均存在染色,在208例胃癌組織中,49.5%(103/208例)呈SIX1高表達(dá)。2、SIX1蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理因素相關(guān)性:SIX1的過表達(dá)與較高的TNM分期,腫瘤大小(T期)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性(p0.05)。通過生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)分析,我們發(fā)現(xiàn)SIX1與患者不良預(yù)后具有顯著相關(guān)性。通過Cox多因素回歸分析,我們發(fā)現(xiàn)T、N分期和復(fù)發(fā)與患者預(yù)后相關(guān),能夠獨(dú)立預(yù)測(cè)患者的不良預(yù)后。3、SIX1促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲:通過MTT實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)SIX1轉(zhuǎn)染增強(qiáng)了SGC-7901胃癌細(xì)胞系的增殖,而SIX1特異性siRNA干擾則抑制了HGC-27細(xì)胞的增殖。通過Transwell實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)SIX1轉(zhuǎn)染增強(qiáng)了細(xì)胞的侵襲能力,而SIX1特異性siRNA干擾則抑制了細(xì)胞的侵襲能力(p0.05)。4、SIX1調(diào)控cyclin D1以及MMP2的表達(dá):在SGC-7901細(xì)胞系中,SIX1過表達(dá)能夠顯著上調(diào)cyclin D1以及MMP2蛋白質(zhì)的表達(dá)量;而在HGC-27細(xì)胞系中,SIX1干擾則抑制了這些蛋白質(zhì)的表達(dá)。5、SIX1調(diào)控ERK信號(hào)通路:SIX1過表達(dá)使ERK的磷酸化水平顯著上調(diào),而SIX1干擾則使ERK的磷酸化水平顯著下調(diào)。6、SIX1調(diào)控EMT:發(fā)現(xiàn)SIX1過表達(dá)使胃癌細(xì)胞中E-cadherin的水平下調(diào),而SIX1干擾使E-cadherin的水平略微上調(diào)。7、miR-429在胃癌組織中表達(dá)下降:通過RT-qPCR的方法檢測(cè)miR-429在15例胃癌組織與對(duì)應(yīng)正常胃組織表達(dá)水平,與正常組織相比,miR-429在胃癌組織中表達(dá)量降低的有9對(duì)。8、miR-429抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲:CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與對(duì)照細(xì)胞相比,miR-429 mimic轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力顯著降低,而miR-429抑制劑轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力顯著高于對(duì)照細(xì)胞。Transwell實(shí)驗(yàn)表明miR-429 mimic轉(zhuǎn)染后的SGC-7901細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的數(shù)目明顯下降,而轉(zhuǎn)染miR-429抑制劑后的SGC-7901細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯增加(p0.05)。9、miR-429在胃癌細(xì)胞中能夠抑制MMP2的表達(dá)量及ERK信號(hào)通路:轉(zhuǎn)染miR-429 mimic后MMP2的蛋白表達(dá)量顯著下降;而轉(zhuǎn)染miR-429抑制劑后MMP2的蛋白表達(dá)量升高。上調(diào)miR-429可抑制ERK通路,而下調(diào)miR-429激活ERK通路。10、SIX1是miR-429在胃癌細(xì)胞直接調(diào)節(jié)的靶基因:Western blot結(jié)果表明miR-429在胃癌細(xì)胞中可以抑制SIX1蛋白的表達(dá)。構(gòu)建了miRNA靶基因報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng),顯示SIX1基因的3'端非編碼區(qū)域是miR-429的直接結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)論:1、SIX1在人類胃癌組織中過量表達(dá)。SIX1的過表達(dá)與較高的TNM分期,腫瘤大小(T期)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),且與患者不良預(yù)后有關(guān)。2、SIX1過表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。3、SIX1通過ERK-MMP2介導(dǎo)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。4、miR-429在胃癌中低表達(dá),并能抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。5、miR-429在胃癌細(xì)胞中通過靶基因SIX1調(diào)控MMP2抑制細(xì)胞的增殖和侵襲。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 結(jié) 果3.1 SIX1 在胃癌組織中過表達(dá)我們采用免疫組化方法檢測(cè)了 SIX1 蛋白在 208 例胃癌組織及癌周非癌組織中的表達(dá)（如圖 1）。SIX1 蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均存在染色。我們發(fā)現(xiàn)，，在 208例胃癌組織中，有 49.5%(103/208 例)呈 SIX1 高表達(dá)；而在癌周非癌組織中 SIX1呈陰性表達(dá)。

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文表 2. 胃癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素分析：?jiǎn)我蛩睾投嘁蛩胤治鯱nivariate Multivariate Hazard ratio(95% CI)p value Hazard ratio(95% CI)verexpression 1.803 (1.236-2.631) 0.0022* 1.03 (0.686-1.548) invasion (T) 1.507 (1.212-1.873) 0.0002* 1.413 (1.116-1.789) status (N) 1.708 (1.454-2.006) <0.0001* 1.435 (1.177-1.749) ntiation 0.806 (0.553-1.174) 0.2608 0.846 (0.567-1.260) e 72.793(26.389-200.8)<0.0001* 83.354(28.914-240.290)* 具有顯著意義
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2702969