【摘要】：MiRNAs是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA,通過剪切靶基因mRNA或抑制蛋白的翻譯調(diào)控真核生物的基因表達(dá)。在植物體內(nèi),miRNAs主要參與了生長發(fā)育、逆境脅迫反應(yīng)等多種生物進(jìn)程。隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展,發(fā)現(xiàn)了大量新的miRNAs,miRNA database已經(jīng)收錄了38589個(gè)miRNAs,然而大多數(shù)miRNA的生物功能及其靶基因仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。研究miRNA的作用,關(guān)鍵是研究miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控。MiRNAs靶基因的驗(yàn)證常用方法包括Northern Blot,Western Blot,降解組測序(Degradome sequencing),MirTrap,RACE(Rapid amplification of cDNA ends)和熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)。利用生物信息學(xué)預(yù)測miRNAs靶基因,采用不同的方法和不同的參數(shù)條件都可能會(huì)得到不同的靶基因,預(yù)測結(jié)果存在假陽性和假陰性,因此,對(duì)預(yù)測的靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證也是必需的。鑒于miRNA靶基因的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過程較為復(fù)雜、耗時(shí),因此,建立一種準(zhǔn)確且快速地預(yù)測和驗(yàn)證miRNA靶基因的方法對(duì)研究miRNA的生物學(xué)功能具有非常重要的意義。利用瞬時(shí)表達(dá)結(jié)合熒光素酶報(bào)告基因建立的檢測系統(tǒng)是靶基因驗(yàn)證的一種快速、簡便的方法。本文利用農(nóng)桿菌所介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá),結(jié)合水稻原生質(zhì)體的瞬時(shí)表達(dá),系統(tǒng)研究了不同體系下miRNAs的動(dòng)態(tài)表達(dá),以及靶基因驗(yàn)證的最佳體系。主要結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了適用于水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)的載體,將miR169o過表達(dá)載體分別與LUC空白載體,靶基因LOC_Os03g48970.1與LUC的融合載體(后稱作LUC-48970)以及LUC-48970m3(及48970突變載體)共轉(zhuǎn)化到水稻原生質(zhì)體中,miR169o和LUC-48970共轉(zhuǎn)化后的LUC活性顯著弱于miR169o和空白融合載體(LUC)共轉(zhuǎn)化,miR169o和LUC-48970m3(即48970的突變)共轉(zhuǎn)化后的LUC活性,表明miR169o可以抑制靶基因LOC_Os03g48970.1的轉(zhuǎn)錄表達(dá),而水稻原生質(zhì)體系統(tǒng)可以用于miRNAs靶基因的檢測。(2)在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后12h,18h,24h,36h分別檢測LUC活性,發(fā)現(xiàn)在24h時(shí),LUC的活性最高,表明24h可能是最適宜觀察熒光的時(shí)期。此外,還利用qRT-PCR檢測了這四個(gè)時(shí)間點(diǎn)成熟miR169o的表達(dá)量,整體來看,miR169o的表達(dá)量與轉(zhuǎn)化時(shí)間具有正相關(guān)性,12h表達(dá)量最低,在24h表達(dá)量上調(diào)至十倍。當(dāng)將miR169o與靶基因融合載體共轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體后,在不同的處理中miR169o的表達(dá)具有一定的差異。綜合miRNAs表達(dá)水平及LUC活性的檢測結(jié)果,建議在miRNAs靶基因的驗(yàn)證中,水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后24h-36h作為后續(xù)最適宜的檢測時(shí)間。(3)構(gòu)建了適用于煙草瞬時(shí)表達(dá)的載體,將攜帶miR169o過表達(dá)載體與LUC空白載體,LUC-48970融合載體,LUC-48970m3載體的農(nóng)桿菌分別共注射到煙草葉片中,檢測LUC活性,發(fā)現(xiàn)miR169o與LUC-48970共表達(dá)中的LUC活性明顯弱于miR169o與LUC共表達(dá),miR169o與LUC-48970m3共表達(dá)中的LUC活性,表明煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可以用于水稻miRNAs的靶基因驗(yàn)證。注射煙草48h,72h,96h檢測LUC活性,發(fā)現(xiàn)72h LUC活性達(dá)到高峰后,又有所降低,表明72h是農(nóng)桿菌注射后最適宜的檢測點(diǎn)。此外,利用qRT-PCR檢測了注射后24h,36h,48h,72h成熟miR169o表達(dá)量,24h表達(dá)量最低,48h時(shí)表達(dá)量已顯著上調(diào),且上調(diào)倍數(shù)達(dá)到近二十倍。綜合這兩方面的檢測結(jié)果,建議在miRNAs靶基因驗(yàn)證體系中,煙草注射菌后48h-72h作為后續(xù)最適宜的檢測時(shí)間。(4)利用構(gòu)建的水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),檢測了mi R812g與其預(yù)測靶基因LOC_Os02g07960.4和LOC_Os04g47140.1,miR5076與其預(yù)測靶基因LOC_Os02g27594.2,miR818a與其預(yù)測靶基因LOC_Os09g36320.1,miR169o與其預(yù)測靶基因之間LOC_Os02g53620.1的對(duì)應(yīng)關(guān)系,發(fā)現(xiàn)除了53620是miR169o的靶基因,其他miRNAs與其預(yù)測的靶基因可能不存在剪切或抑制關(guān)系。本文通過對(duì)miRNAs及熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)分析,建立了水稻miRNAs靶基因的瞬時(shí)驗(yàn)證系統(tǒng),該系統(tǒng)為水稻miRNAs靶基因驗(yàn)證提供了一種簡便、快速,且更接近于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的方法,進(jìn)而為研究miRNAs生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

1.1 miRNAs 的生物合成過程，摘自 Yu et al., 21.1 the process of miRNAs biogenesis from Yu et學(xué)功能小分子 RNA，在植物體內(nèi)發(fā)揮著重要的 分子的切割或抑制翻譯來調(diào)節(jié)植物基因物器官的形態(tài)建成，如花（Gao et al., 2響應(yīng)植物對(duì)生物逆境脅迫，主要是病原17）和病毒（Yang et al., 2016）等，以及t al., 2017）、干旱脅迫（陳禹彤等，2015等。因的作用機(jī)制基因的方式主要有兩種：剪切 mRNA 和同，，與 miRNA 和靶基因的互補(bǔ)程度有關(guān)NA特異性切割；如果miRNA與靶基因

過表達(dá) miR169o，會(huì)降低水稻對(duì) Xoo 的抗病性（Yu et al., 20o 與其靶基因 48970 的對(duì)應(yīng)關(guān)系為參照，來系統(tǒng)研究 miRNAs 的動(dòng)態(tài)表達(dá)模瞬時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)化采用 PEG 法（Maas et al., 1989; 王華忠等，2007)。PEG主要作用是可以使原生質(zhì)體的膜電位降低，從而進(jìn)行凝聚。此外，PEG 還夠擾亂并分散于原生質(zhì)膜表面的蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的排列方式，進(jìn)而來提高脂將載體融合到植物的原生質(zhì)體細(xì)胞中，完成轉(zhuǎn)化。原生質(zhì)體濃度、質(zhì)粒濃處理時(shí)間等都會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率（Baranski et al., 2007）。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化中文所采用的各項(xiàng)指標(biāo)如下：原生質(zhì)體濃度為 2-5×106個(gè)細(xì)胞/mL，質(zhì)粒濃度40% PEG 4000，PEG 處理時(shí)間為 15min。該方法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)材料的處理可而可以更直接地研究外源基因在細(xì)胞內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)。與材料、載體與菌株用的水稻品種是日本晴（Oryza. Sativa L. cv. Nipponbare），所用的大元表達(dá)載體 pUC19-nLUC（保存于 E. coli）為實(shí)驗(yàn)室所保存，載體圖見圖
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳禹彤;陳華民;余超;Amy Thein;田芳;何晨陽;;水稻miR169o及其靶基因OsNF-YAs對(duì)缺水脅迫的早期表達(dá)模式[J];生物技術(shù)通報(bào);2015年08期

2 王政;方和娣;陳宇;李冠英;譚小力;;甘藍(lán)型油菜BnMKS1基因的克隆、亞細(xì)胞定位及其誘導(dǎo)表達(dá)[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2013年06期

本文編號(hào)：2702609