【摘要】：血紅蛋白廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)。在植物中,植物血紅蛋白在調(diào)控根瘤固氮、體細(xì)胞胚胎發(fā)生和抗逆反應(yīng)等方面具有重要功能。在大豆(Glycine max L.)中高鐵豆血紅蛋白還原酶(Ferric leghemoglobin reductase,FLbR)將高鐵豆血紅蛋白(Ferric leghemoglobin,Lb~(3+))還原為亞鐵血紅蛋白(Ferrous leghemoglobin,Lb~(2+)),在根瘤固氮中Lb~(2+)對(duì)于氮素固定來(lái)說(shuō)是必要條件。通過(guò)改善GmFLbR的酶活性,增加Lb~(2+)的含量,從而提高根瘤的固氮能力,將為大豆以及其他農(nóng)作物提高固氮效率提供更多的基因資源。本文主要研究結(jié)果如下:1.通過(guò)篩選EMS誘變的大豆突變體庫(kù),獲得了Glycine max Ferric Leghemoglobin Reductase(Gmflbr)突變體,與野生型Williams82相比,突變體Gmflbr葉片苗期出現(xiàn)紅褐色斑點(diǎn),隨著生長(zhǎng)發(fā)育,斑點(diǎn)數(shù)量逐漸增多且葉片變黃脫落;同時(shí),突變體Gmflbr次級(jí)根系量、根瘤數(shù)量及體積顯著降低。葉綠素SPAD值和凈光合速率隨著植物生長(zhǎng)發(fā)育逐漸降低,然而,胞間二氧化碳濃度持續(xù)顯著高于野生型Williams82;2.通過(guò)原位雜交分析GmFLbR在葉原基的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)該基因在頂端分生組織、側(cè)生葉芽及葉原基均有表達(dá),說(shuō)明Gm FLbR基因在植物葉發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用;3.構(gòu)建GmFLbR的CRISPR/Cas9載體,目前正進(jìn)行大豆遺傳轉(zhuǎn)化工作,預(yù)期獲得與突變體相同表型轉(zhuǎn)基因植株,進(jìn)行進(jìn)一步基因功能的驗(yàn)證;4.篩選EMS誘變的大豆突變體庫(kù),通過(guò)對(duì)葉形突變體msp6214的F2群體進(jìn)行了圖位克隆,將突變基因定位于18號(hào)染色體6.02 M-6.55 M區(qū)間內(nèi);5.通過(guò)石蠟切片對(duì)突變體msp6214葉片進(jìn)行觀察分析,推測(cè)由于木質(zhì)部、韌皮部、韌皮部纖維及厚角組織的一系列變化,導(dǎo)致葉片近-遠(yuǎn)軸極性紊亂,從而造成突變體葉片翻卷表型。
【圖文】：

大豆豆血紅蛋白還原酶（GmFLbR）基因的圖位克隆和功能初步分析和 COX將 NO2-還原為 NO，NO隨即擴(kuò)散至細(xì)胞基質(zhì)中，通過(guò) Pgbs 氧化成 NO3-；硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase, NR）將其還原為 NO2-，，NO2-通過(guò)亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白 （ Nitrite transporter, NiT ） 再 次 運(yùn) 輸 至 線 粒 體 內(nèi) 部 ， 從 而 形 成NO2--NO-NO3--NO2-的循環(huán)系統(tǒng)。同時(shí)，在類菌體內(nèi)同樣進(jìn)行著相似的氧化還原反應(yīng)。NADH-對(duì)苯二酚氧化還原酶（NADH-quinol Oxidoreductase, DH）氧化NADH，產(chǎn)生的電子通過(guò) Cyt c 實(shí)現(xiàn)反硝化作用，在不同酶的作用下將 NO3-依次還原成 NO2-、NO和 N2[20]。nsHb通過(guò)間接調(diào)節(jié)植物體內(nèi) NO合成水平，使植物適應(yīng)缺氧等極端環(huán)境，此外，nsHb 也有類過(guò)氧化物酶活性，通過(guò)參與 NO 的生理代謝反應(yīng)，保護(hù)植物在與病菌的相互作用中免受硝化脅迫。

圖 2.1 V2 期 Williams82 與 Gmflbr表型比較Figure 2.1 Compare with the phenotype in Williams82 and Gmflbr at V2 stage植株表型；B. 真葉表型Phenotype of entire plant; B. Phenotype of rough leaf當(dāng)植物細(xì)胞發(fā)生損傷（細(xì)胞膜不完整、破裂）或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，染料進(jìn)入細(xì)胞后，結(jié)合解體的 DNA，變藍(lán)區(qū)域即為壞死細(xì)胞，著色程度可以指示植物組織細(xì)胞的壞死程度；同時(shí)，活細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，能夠阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，因此，完整的細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)所染色。在 V3時(shí)期，取倒數(shù)第二對(duì)三出復(fù)葉的中間葉片拍照對(duì)比并進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色。圖 2.2A 為臺(tái)盼藍(lán)染色前，野生型與突變體葉片對(duì)比，野生型 Williams82 葉色均
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S565.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 張玉林;張縉鸞;周玉英;吾甫爾;;遺傳性高鐵血紅蛋白血癥(NADH高鐵血紅蛋白還原酶缺乏)[J];新疆醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1987年02期

2 C.A.Appleby ,徐志偉;南山麻黃屬的血紅蛋白:有關(guān)植物血紅蛋白的起源[J];亞熱帶植物通訊;1987年01期

本文編號(hào)：2701365