【摘要】：甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是豆科甘草屬植物,以根莖入藥,具有鎮(zhèn)痰止咳、補(bǔ)脾益氣等作用,是我國傳統(tǒng)大宗常用中藥材,甘草苷是《中華人民共和國藥典》中評價甘草質(zhì)量的兩個指標(biāo)之一。目前人工栽培甘草中普遍存在甘草苷含量低的問題,不能滿足入藥標(biāo)準(zhǔn)。揭示甘草苷合成途徑關(guān)鍵基因的功能是甘草品質(zhì)育種的重要前提,通過毛狀根培養(yǎng)合成甘草苷也是緩解甘草苷供需矛盾的重要途徑。本文將查爾酮異構(gòu)酶基因通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入甘草子葉節(jié)中誘導(dǎo)毛狀根發(fā)生,考察了菌株類型、侵染時間、共培養(yǎng)時間等對轉(zhuǎn)化率的影響,測定毛狀根鮮重和甘草苷含量,篩選優(yōu)良單克隆根系;通過基本培養(yǎng)基篩選、pH值處理和YE誘導(dǎo)子處理,以建立高效培養(yǎng)體系。主要研究內(nèi)容如下:1、甘草CHI-OE毛狀根的誘導(dǎo)及鑒定:用發(fā)根農(nóng)桿菌K599、Aqua1侵染甘草子葉節(jié),對侵染時間、共培養(yǎng)時間進(jìn)行考察,結(jié)果表明,發(fā)根農(nóng)桿菌K599誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)化率均優(yōu)于Aqua1,分別為86.5%、76.2%,農(nóng)桿菌侵染子葉節(jié)的適合時間為20min,侵染后共培養(yǎng)時間為3d,誘導(dǎo)效果最好。與Aqua1相比,K599誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根早1-2d,且根系生長速度快,根系粗壯,分支多。2、優(yōu)良單克隆根系的篩選:以鮮重和甘草苷為指標(biāo),對陽性毛狀根進(jìn)行篩選,結(jié)果表明,繼代后大部分根系生長緩慢甚至停滯,在生長穩(wěn)定的根系中篩選到8個根系甘草苷含量優(yōu)于對照。其中C11根系生長最快,鮮重最高為4.73g,甘草苷含量為0.054%,是對照的2.3倍,而C44根系甘草苷含量最高,為0.059%,為對照的2.6倍。熒光定量結(jié)果表明,根系C44和C11中基因的相對表達(dá)量較高,分別是對照的19和17倍。3、培養(yǎng)體系的優(yōu)化:以C44為材料,分析基本培養(yǎng)基、pH值、誘導(dǎo)子濃度及誘導(dǎo)子添加時間對毛狀根鮮重和甘草苷產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明:C44根系在1/2MS液體培養(yǎng)基中生長速率最快,鮮重為4.79g,增殖倍數(shù)為15.96倍,甘草苷含量為0.059%;不同pH值下毛狀根生長速度和甘草苷積累量不同,pH值為5.8時毛狀根中甘草苷含量最高,為0.058%,鮮重為4.91g,增殖倍數(shù)為16.37倍;YE濃度和添加時間對毛狀根生長速度影響不顯著,但在第10d添加0.1mg/mL的YE誘導(dǎo)子,甘草苷含量顯著提高,是對照的1.2倍。本研究建立了甘草查爾酮異構(gòu)酶超表達(dá)基因的毛狀根誘導(dǎo)體系,篩選了生長速度和甘草苷含量均高于對照的優(yōu)良毛狀根株系,并建立了優(yōu)良的培養(yǎng)體系,為合成甘草苷以及研究甘草苷代謝相關(guān)基因的功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.71

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙雪巍;劉培玉;劉丹;孫珊珊;李貞;余可馨;張Z誒，

本文編號：2701267