【摘要】：豬胃蛋白酶是一種酸性水解酶,在飼料、食品、皮革、醫(yī)藥等方面有著廣泛應(yīng)用。本文將來(lái)源于豬的胃蛋白酶基因成功整合到畢赤酵母GS115基因組上,并在畢赤酵母中成功表達(dá)。在搖瓶水平下,通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化,豬胃蛋白酶在BMGY-1培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),在添加甲醇至終濃度為2.5%的BMMY-1培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá),第9 d達(dá)到最大酶活2322 IU/mL。產(chǎn)豬胃蛋白酶畢赤酵母菌株10 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng),豬胃蛋白酶酶活最高達(dá)到11388 IU/mL,較搖瓶發(fā)酵酶活提高了 4.9倍。轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(tRNA)是蛋白質(zhì)合成過(guò)程中重要參與成分之一,為了探索稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA(稀少tRNA)豐度改變對(duì)外源基因表達(dá)量的影響,本文構(gòu)建了畢赤酵母稀少tRNA基因與外源基因共表達(dá)體系。首先在GFP基因中添加由4個(gè)連續(xù)脯氨酸稀有密碼子CCG組成的阻遏區(qū),結(jié)果顯示該GFP基因的表達(dá)量明顯降低。然后將帶有阻遏區(qū)的GFP基因和tRNACCGPro基因順次連接于pPIC9K載體上,在畢赤酵母GS115中共表達(dá),結(jié)果使GFP表達(dá)量提高了 4.9%;另將帶有阻遏區(qū)的GFP基因和tRNACCGPro基因分別連接于pPIC9K和pFLDα載體,在畢赤酵母GS115中共表達(dá),GFP表達(dá)量最高提高了 12.5%;應(yīng)用同樣方式將tRNACCGPro基因與NFATc3T-GFP融合基因共表達(dá),其表達(dá)量提高了 21.3%�？梢�(jiàn),tRNACCGPro在畢赤酵母GS115中確為稀少tRNA,通過(guò)共表達(dá)tRNACCGPro基因可顯著提高帶有連續(xù)該密碼子的外源基因表達(dá)量,并且,本文構(gòu)建的共表達(dá)體系將同樣適用于其他稀少tRNA基因的篩選和驗(yàn)證。同時(shí),驗(yàn)證得到添加tRNA共表達(dá)在基本培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)比在豐富培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)勢(shì)更加明顯。
【圖文】：

圖２－１酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ逡逑．５．４待測(cè)酶液的制備逡逑各�。卞澹恚叹海ㄍ囵B(yǎng)三組平行），１２０００邋ｒ／ｍｉｎ離心５邋ｍｉｎ，取合適體清液，用ｐＨ邋２．０乳酸－乳酸鈉緩沖液稀釋到一定濃度，使得測(cè)定的ＯＺ）２８Ｑ值位曲線(xiàn)之內(nèi)。逡逑．５．５胃蛋白酶酶活的測(cè)定逡逑１）先將酪蛋白溶液放入測(cè)定溫度４０°Ｃ的水浴鍋中，預(yù)熱５邋ｍｉｎ；逡逑２）操作步驟如下：逡逑離心管Ａ邋（對(duì)照組）邐離心管Ｂ邋（實(shí)驗(yàn)組）逡逑Ｉ邐Ｉ逡逑Ｖ邐Ｖ逡逑加酶液２５０邋［ｉＬ邐加酶液２５０邋ｆｉＬ逡逑N測(cè)定溫度水�。玻恚椋钸奛測(cè)定溫度水浴２邋ｍｉｎ逡逑Ｖ邐Ｖ逡逑力口０＿４１１１0１／１：１：０八５００（１］：（搖勻）邋加酪蛋白２５０邋ｐＬ邋（搖勻）逡逑１邐１逡逑

２邋忖料與方；＇ｊ，邐逡逑為了給待驗(yàn)證的伙基因提供對(duì)照，構(gòu)建了包含不能識(shí)別密碼子ＣＣＧ的逡逑皂的基因的載體ｐＦＬＤｃｃ－ｔＲＮＡ巧Ａ邋（簡(jiǎn)寫(xiě)ｐｔＲＮＡ二Ａ）。逡逑表２－５實(shí)驗(yàn)用引物逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－５邋Ｔｈｅ邋ＰＣＲ邋ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｕｓｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ逡逑ｙ邋ＰＣＲ邐Ｐｒｉｍｅｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５’－３’）逡逑ＴＡＣＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＣＣＧＣ逡逑ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＣＡＡＴＴ逡逑ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＡＴＴＣＡＣＴ逡逑ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＡＡＴＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＣＴＣＧＧＧ逡逑ＣＧＣＧＧＡＴＧＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＴＡＧＡＡＴＣＡＡＧＡ逡逑ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣ逡逑ＣＧＣＧＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＣＧ逡逑ＣＧＣＧＧＡＴＧＣＡＴＣＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＣＧＡＴ逡逑ｙ邐ＡＴＧＴＣＧＡ．ＡＡＧＧＧＧＡＡ邋ＧＡＡ邋—、（；ＦＰ４ＣＣ（；逡逑
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孟憲芳,施靜,劉曉春,陳金中;Prokaryotic Expression and Preparation of Polyantibody of Human Histydyl-tRNA Synthetase Related Gene[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2004年06期

2 涂華民,楊燕生,李勇,王恩多;Effect of Rare Earth Ions on Kinetic Properties of Escherichia coli Leucyl-tRNA Synthetase[J];Journal of Rare Earths;2000年03期

3 郭慶,薛紅;色氨酸t(yī)RNA個(gè)性元件的研究[J];生命的化學(xué);1999年04期

4 Ohyama;K. Kaneko,I;Ohkuma,S.;賈建芳;;兩種纈氨酰tRNA合成酶活性和同功tRNA�；崴忾g的關(guān)系[J];微生物學(xué)雜志;1987年01期

5 松崎慶子;張雨青;;突變型家蠶中丙氨酸t(yī)RNA基因的克隆[J];國(guó)外農(nóng)學(xué)-蠶業(yè);1987年03期

6 張健;范寶玲;;tRNA的新功能[J];生命的化學(xué)(中國(guó)生物化學(xué)會(huì)通訊);1987年03期

7 羅貴民;;生物技術(shù)的新工具——反向tRNA[J];生命的化學(xué)(中國(guó)生物化學(xué)會(huì)通訊);1987年03期

8 裘慕綏,金由辛,李文琴,包俊茹,龔佩娟,吳仁龍,鄭可沁,王德寶;BIOLOGICAL FUNCTION OF MODIFIED NUCLEOTIDES IN tRNA MOLECULES——SYNTHESIS AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF THE ANALOGUES OF YEAST ALANYL tRNA WITH I_(34) REPLACED BY A_(34) OR G_(34)[J];Science in China,Ser.B;1988年06期

9 黃守廷,張星岳,李冰,林勝祥;E.coli tRNA~(Leu)的提純[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1988年05期

10 曹功杰,馮曉黎,祁國(guó)榮;5′-和3′-末端帶雙羥基的寡聚核糖核苷酸具有不尋常的聚丙烯酰胺凝膠電泳行為[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1988年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 ;High-Level Expression and Single-Step Purification of Human Tryptophanyl-tRNA Synthetase[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第八屆會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2001年

2 邵遠(yuǎn)軍;李兵;彭廣大;胡顯瓊;查宏賢;趙建欣;王永州;沈衛(wèi)德;李瑞;;家蠶追寄蠅線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b基因及其側(cè)翼tRNA基因的克隆與序列結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析[A];全國(guó)家蠶病害控制技術(shù)與安全養(yǎng)蠶模式學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

3 薛凌;陳紅;孟燕子;王燕;呂建新;管敏鑫;;高血壓與線(xiàn)粒體tRNA突變的關(guān)系[A];“細(xì)胞活動(dòng) 生命活力”——中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)全體會(huì)員代表大會(huì)暨第十二次學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2011年

4 ;Transfer RNAs Evolve through Retrotransposition[A];基因開(kāi)啟未來(lái)：新時(shí)代的遺傳學(xué)與科技進(jìn)步——湖北省遺傳學(xué)會(huì)第八次代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編[C];2009年

5 Jia-Yi Fan;Quan-Quan Ji;Qian Huang;En-Duo Wang;;One LeuRS leucylates type Ⅰ and Ⅱ tRNA~(Leu)s in Streptomyces coelicolor[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨2018年全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議摘要集[C];2018年

6 王恩多;;tRNA中幾個(gè)位點(diǎn)的甲基化修飾[A];2017第七屆泛環(huán)渤海生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2017年

7 Wei Li-juan;An Ze-shan;XiaoMei-li;Li Jia-na;Fu Dong-hui;;Extensive tRNA gene changes in synthetic Brassica napus between Brassica rapa and Brassica oleracea[A];中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編（2009-2013）[C];2013年

8 Wei Xie;Xiangjing Qin;Zhitai Hao;Qingnan Tian;;Structural and biochemical studies of the human GlyRS in complex with tRNA~(Gly)[A];第四屆中國(guó)結(jié)構(gòu)生物學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2013年

9 陳鑫;王恩多;;Functional Association between Human Cytoplasmic Leucyl-and GlutamyI-Prolyl-tRNA Synthetases Enhances Aminoacylation of tRNA~(Pro)[A];第二屆全國(guó)“跨學(xué)科蛋白質(zhì)研究”學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2008年

10 劉荻;付漢江;鄭曉飛;;應(yīng)激誘導(dǎo)tRNA半分子檢測(cè)方法建立及其結(jié)合蛋白研究[A];第九屆全國(guó)核糖核酸學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2016年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王煒;結(jié)核分枝桿菌氨酰tRNA合成酶催化機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2018年

2 任凱達(dá);急性心梗患者的線(xiàn)粒體tRNA突變以及流行病學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2018年

3 徐敏剛;亮氨酰-tRNA合成酶和tRNA～（Leu）的相互作用，

本文編號(hào)：2701146