【摘要】：H9N2亞型流感病毒是目前我國(guó)主要的流行的一種低致病性流感病毒,具有宿主范圍廣,可感染家禽、豬、馬等多種哺乳動(dòng)物,導(dǎo)致宿主生產(chǎn)性能下降及免疫抑制病等。H9N2亞型流感病毒還可能與其他病原共感染導(dǎo)致高死亡率,給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí),H9N2亞型流感病毒具有很強(qiáng)的傳播能力,且無(wú)需經(jīng)過中間宿主,即可突破種間屏障感染哺乳動(dòng)物和人,極大地威脅了公共健康安全。2013年,本實(shí)驗(yàn)室從山東省中東部地區(qū)有呼吸道癥狀水貂的肺組織中分離到H9N2亞流感病毒A/mink/Shangdong/F6/2013和A/mink/Shangdong/F10/2013。2015年,本實(shí)驗(yàn)室從山東省中東部地區(qū)有呼吸道癥狀水貂的肺組織中分離到株貂源H9N2亞型流感病毒。本實(shí)驗(yàn)室于2016年8月在該區(qū)表現(xiàn)有呼吸道癥狀的發(fā)病貉子和狐貍種群中分離得到八株流感病毒,經(jīng)鑒定為H9N2亞型流感病毒,命名為A/Raccoon dog/Shandong/G1/2016,A/Raccoon dog/Shandong/G5/2016,A/Raccoon dog/G7/Shandong/2016,A/Raccoon dog/Shandong/G13/2016,A/Raccoon dog/Shandong/G31/2016,A/Raccoon dog/Shandong/G41/2016,A/Raccoon dog/Shandong/G55/2016,A/Fox/Shandong/G60/2016。根據(jù)Genbank公布的H9N2亞型流感病毒的基因序列,分別設(shè)計(jì)各基因片段的特異性引物,采用RT-PCR方法擴(kuò)增八株分離毒株的HA、NA、PA、PB1、PB2、NS、NP、M各段基因,并與Gen Bank中流感病毒各基因序列進(jìn)行了同源性比較和氨基酸編碼分析,繪制了8個(gè)基因片段的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。同源性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),八株分離毒株的8個(gè)基因片段的同源性為91.1%~100%。分子遺傳進(jìn)化分析表明,HA基因?qū)倭薡280-like分支,M基因?qū)儆贕1-like分支,NP屬于Y439-like分支,NA、NS、PA、PB1基因均屬于F/98-like分支,PB2屬于Korea-like分支。由此可知,八株分離株的各基因所屬分支不具有統(tǒng)一性,可推測(cè)出本研究所分離的八株H9N2亞型流感病毒毒株可能是來源于不同亞系,因此該分離流感病毒的毒株可能是重組病毒。進(jìn)一步分析八株分離毒株的分子生物學(xué)特性,通過DNAStar軟件推導(dǎo)分離毒株的氨基酸序列,并與參考毒株進(jìn)行分析比較。氨基酸序列分析結(jié)果表明,8株分離株的氨基酸序列同源性為99.3~100%;8株分離毒株HA蛋白的第234位氨基酸均為亮氨酸(Leu),具有SAα-2,6-Gal的受體結(jié)合特性;在HA蛋白的裂解位點(diǎn)處氨基酸序列為PSRSSR↓GL,符合低致病性流感病毒的特點(diǎn);HA蛋白含有8個(gè)潛在糖基化位點(diǎn),與參考毒株相比,8株分離毒株均在218位缺失了一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn),在313位氨基酸處增加了一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn);8株分離毒株P(guān)B2蛋白的627位氨基酸位點(diǎn)為賴氨酸(Lys),說明8株毒株具有哺乳動(dòng)物受體結(jié)合特性。本研究證實(shí)了貉和狐能夠感染H9N2亞型流感病毒,這不僅可能會(huì)對(duì)皮毛動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成危害,因此可能通過狐和貉的感染從而導(dǎo)致飼養(yǎng)人員的感染,存在一定的安全隱患。為了解H9N2亞型流感病毒在狐和貉上的流行以及基因的進(jìn)化情況,本研究通過對(duì)H9N2亞型流感病毒分離株進(jìn)行全基因組的序列測(cè)定與分析,探究分離株各基因片段的來源與遺傳變化規(guī)律,豐富了H9N2亞型流感病毒的流行數(shù)據(jù)。
【圖文】：

貉源和狐源 H9N2 流感病毒的分離鑒定及其全基因序列分析3.3 貉源和狐源 H9N2 亞型流感病毒各段基因的 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果分別對(duì)八株病毒的 HA、NA、M、NS、NP、PA、PB1、PB2 八個(gè)基因片段進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到的相應(yīng)的片段，對(duì)應(yīng)的片段大小分別為 1742bp、1500bp、1468bp、1030bp、888bp、2337bp、2326bp、2229bp，與理論片段大小一致。經(jīng) 1％瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果如下圖 3～10 所示。

貉源和狐源 H9N2 流感病毒的分離鑒定及其全基因序列分析3.3 貉源和狐源 H9N2 亞型流感病毒各段基因的 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果分別對(duì)八株病毒的 HA、NA、M、NS、NP、PA、PB1、PB2 八個(gè)基因片段進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到的相應(yīng)的片段，對(duì)應(yīng)的片段大小分別為 1742bp、1500bp、1468bp、1030bp、888bp、2337bp、2326bp、2229bp，，與理論片段大小一致。經(jīng) 1％瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果如下圖 3～10 所示。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2697871