【摘要】：在本實驗室前期系列肉仔雞磷營養(yǎng)研究成果的基礎(chǔ)上,本研究通過進行如下三個試驗,研究建立體外原代培養(yǎng)AA肉雞雞胚十二指腸上皮細胞吸收模型,并應(yīng)用此模型研究磷在原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞中的吸收規(guī)律及其對相關(guān)磷轉(zhuǎn)運載體的表達。試驗一研究不同接種密度及不同培養(yǎng)時間對原代培養(yǎng)AA肉雞雞胚十二指腸上皮細胞緊密連接性及細胞活力的影響,最終構(gòu)建十二指腸上皮細胞原代培養(yǎng)吸收模型。該試驗采用單因子完全隨機試驗設(shè)計,設(shè)3個細胞接種密度[2.9×10~6個/mL(一組)、6.2×10~6個/mL(二組)與8.8×10~6個/mL(三組)],共3個處理組,每個處理組6個重復(fù),共培養(yǎng)4天。結(jié)果表明:1)剛分離的十二指腸上皮細胞團呈球形,且細胞團的大小均一,懸浮于培養(yǎng)液中,貼壁后細胞團開始向外伸展,逐漸鋪成片,細胞之間界限清晰、貼壁均勻,呈單層“鋪路石樣”生長;2)經(jīng)堿性磷酸酶染色,陽性處理組的十二指腸上皮細胞胞漿被染成了藍黑色,陰性對照組的十二指腸上皮細胞不著色,本試驗所培養(yǎng)的細胞均為十二指腸上皮細胞;3)在細胞培養(yǎng)的48和72 h,一組和二組細胞的跨膜電阻(Transepithelial Electrical Resistance,TEER)值(分別為:458、467Ω·cm~2(一組),411、380Ω·cm~2(二組))均滿足大于300Ω·cm~2的試驗要求,酚紅透過率(分別為:2.20、1.19%(一組),3.09、1.81%(二組))均滿足小于5%的試驗要求,并且一組的跨膜電阻TEER值均顯著大于其它兩組(P0.03),細胞酚紅透過率均顯著小于其它兩組(P0.002);4)在細胞培養(yǎng)的24和48 h,一組的LDH酶活力較其他兩組均維持在較低水平(P0.0001)。以上結(jié)果表明,細胞接種密度為2.9×10~6個/mL與培養(yǎng)時間為48h時,細胞間界限清晰、生長狀態(tài)良好、緊密連接性強,細胞活力最佳,即表明原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞物質(zhì)吸收模型構(gòu)建成功,為后續(xù)磷在十二指腸上皮細胞的吸收規(guī)律及其分子機制的研究提供了良好的試驗?zāi)Ｐ�。試驗二研究不同磷孵育時間下原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞中的轉(zhuǎn)運吸收規(guī)律,根據(jù)磷的吸收與孵育時間的曲線關(guān)系以確定細胞最佳孵育時間,為在細胞最敏感的狀態(tài)下研究磷的吸收提供試驗依據(jù)。該研究采用單因子完全隨機試驗設(shè)計,設(shè)8個磷孵育時間點(0、10、20、40、60、80、100和120 min),共8個處理組,每個處理組6個重復(fù)。結(jié)果表明:在細胞進行磷孵育不同時間點,十二指腸上皮細胞的磷吸收率存在顯著差異(P0.0001)。在孵育時間0-80 min之間,細胞磷吸收率隨著磷孵育時間的增加而線性增加,在這一線性增加的時間范圍內(nèi),選擇中間位置時間點40 min作為研究不同孵育濃度下細胞磷吸收動力學(xué)規(guī)律的最佳孵育時間;用二次曲線、漸近線、斷線三種曲線擬合的方法對磷吸收率數(shù)據(jù)擬合相應(yīng)的曲線模型發(fā)現(xiàn),以漸近線法擬合曲線模型的擬合度最好,因此選用漸近線擬合模型求出的磷吸收率達到飽和的時間點為87min,作為研究不同磷孵育濃度下細胞磷吸收相關(guān)轉(zhuǎn)運載體表達的分子機制的最佳孵育時間。試驗三在試驗二確定最佳孵育時間的基礎(chǔ)上,研究不同磷孵育濃度下磷在原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞中的動力學(xué)吸收規(guī)律及其對相關(guān)轉(zhuǎn)運載體基因表達的影響。該研究采用單因子的完全隨機試驗設(shè)計,設(shè)計8個磷水平0.0、0.75、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0和48.0 mmol/L的含磷孵育液,共8個處理組,每個處理組6個重復(fù),在孵育時間40 min時研究不同磷孵育濃度下細胞中磷吸收動力學(xué)規(guī)律,在孵育時間87 min時研究不同磷孵育濃度(0.0、6.0和48.0 mmol/L)下磷相關(guān)轉(zhuǎn)運載體表達的分子機制。結(jié)果表明:1)在不同的磷孵育水平下,肉雞雞胚十二指腸上皮細胞磷吸收率呈線性或曲線顯著增加(P0.0001),并且原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞對磷的吸收動力學(xué)規(guī)律最適合飽和載體轉(zhuǎn)運加非飽和擴散模型;2)孵育液中添加磷(6.0 mmol/L)顯著抑制(P0.04)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞中NaP-Ⅱb mRNA表達,顯著促進(P0.0001)細胞中PiT-2 mRNA表達,而對PiT-1 mRNA表達及NaP-Ⅱb、PiT-1、PiT-2蛋白的表達沒有顯著影響(P0.15);3)孵育液中添加磷(48.0 mmol/L)顯著抑制(P0.04)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞中NaP-Ⅱb、PiT-1的mRNA和蛋白表達,顯著促進(P0.0001)細胞中PiT-2 mRNA的表達,而對PiT-2蛋白的表達沒有顯著影響(P0.15)。以上結(jié)果表明,原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞對無機磷的吸收符合飽和載體轉(zhuǎn)運加非飽和擴散模型。并且,當(dāng)孵育液中磷添加過量時,原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞通過降低NaP-Ⅱb和PiT-1的mRNA及蛋白的表達而限制對磷的吸收。綜上所述,細胞密度約為3×10~6個/mL,在細胞培養(yǎng)的48 h,成功構(gòu)建原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細胞的物質(zhì)吸收模型;無機磷在原代培養(yǎng)十二指腸上皮細胞中的磷吸收方式以非飽和擴散加飽和載體轉(zhuǎn)運為主;當(dāng)孵育液中磷添加過量時,細胞通過下調(diào)NaP-IIb、PiT-1 mRNA和蛋白表達水平及上調(diào)PiT-2 mRNA的表達,而限制對磷的吸收,這可能是細胞為了避免磷吸收過量而中毒的自我反饋調(diào)節(jié)機制。
【圖文】：

從空轉(zhuǎn)運體的重定位（8-1）獲得電性，并且在跨膜電場（1-2a）中結(jié)合1個Na賴性轉(zhuǎn)運，但是這個過程只轉(zhuǎn)運Na+不轉(zhuǎn)運P；第二階段是不依賴于電壓的轉(zhuǎn)運Na+的轉(zhuǎn)運體在細胞膜上移動，結(jié)合第二個Na+，之后誘導(dǎo)磷與該轉(zhuǎn)運體作用結(jié)合第三個Na+，此時，該轉(zhuǎn)運載體一共負載三個Na+和一個磷酸根，NaP-II蛋，并實現(xiàn)向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，最終在細胞膜內(nèi)側(cè)將三個Na+和一個磷酸根釋放，a+- Na+-Pi- Na+的先后結(jié)合順序，是逆電中性的過程。NaP-IIc被發(fā)現(xiàn)主要在小鼠腎臟對磷的重吸收（Segawa 等，2002）。III 型鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運載體包括兩種，載體1（Inorganic Phosphate Transporter1，，PiT-1）和無機磷轉(zhuǎn)運載體2（Inorganicter 2，PiT-2），主要在鼠小腸的刷狀緣膜和隱窩/絨毛軸上皮細胞以及神經(jīng)元、，維持細胞磷的轉(zhuǎn)運、及體內(nèi)磷穩(wěn)態(tài)（Collins 等，2004； Inden 等，2013），1 在十二指腸頂膜上表達（Giral 等，2009）。另外，還在磷誘導(dǎo)的小鼠血管平揮了重要作用（Li 等，2006；Dai 等，2013），并發(fā)現(xiàn)PiT-2 也參與在這amel 等，2013）。并且，PiT-1和PiT-2已被證實具有保守性的磷轉(zhuǎn)運功能，參與胞礦化等（B ttger和Pedersen，2005）。III 型鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運載體在腸道轉(zhuǎn)運磷（Virkki 等，2007），在先后結(jié)合Na+和P時既有序又隨機，是一個混合型的合Na+也可以先結(jié)合P，最終該轉(zhuǎn)運載體共結(jié)合兩個Na+和一個磷，從而發(fā)生電細胞膜內(nèi)側(cè)將兩個Na+和一個磷酸根釋放。

圖1-2 NaP-III轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運磷的機制（Virkki 等，2007）ure 1-2 The transport mechanism of type III sodium-dependent phosphate transporters（Virkki 等鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運載體在雞上的研究已有一些報道。研究表明，NaP-IIb主要在雞A 表達水平在十二指腸最高（Han 等，2009；Fang 等，2012；劉松柏，20有利于促進肉仔雞十二指腸NaP-IIb mRNA表達（Liu 等，2016）。Nie 等（20指腸NaP-Ⅱb mRNA表達水平隨著飼糧中非植酸磷水平的升高而降低。本實驗采用自然飼喂法研究報道，NaP-IIb mRNA主要在肉雞十二指腸表達，而Pi要在其回腸表達；飼糧低磷水平可促進肉雞十二指腸NaP-IIb和PiT-1 mRNA 的2 mRNA表達。然而，Bai 等（2000）報道，PiT-2 蛋白在小鼠空腸表達最高。在肉仔雞小腸中的吸收規(guī)律及其分子機制的研究結(jié)果表明，十二指腸是肉仔雞aP-IIb mRNA 表達的主要部位，并且無機磷在肉仔雞十二指腸中的吸收以飽和（劉松柏，2012；Liu 等，2016），飼糧無機磷可通過上調(diào)肉仔雞十二指腸NaP-I水平并降低PiT-1 蛋白表達水平，而促進肉仔雞小腸對磷的吸收（Hu 等，20道磷吸收的主要部位是肉雞等畜禽吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，其中無機磷在整個小腸均可以被吸收
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S831.5

【參考文獻】

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本文編號：2697034