【摘要】：在本實(shí)驗(yàn)室前期系列肉仔雞磷營(yíng)養(yǎng)研究成果的基礎(chǔ)上,本研究通過(guò)進(jìn)行如下三個(gè)試驗(yàn),研究建立體外原代培養(yǎng)AA肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞吸收模型,并應(yīng)用此模型研究磷在原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞中的吸收規(guī)律及其對(duì)相關(guān)磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)。試驗(yàn)一研究不同接種密度及不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)原代培養(yǎng)AA肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞緊密連接性及細(xì)胞活力的影響,最終構(gòu)建十二指腸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)吸收模型。該試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)3個(gè)細(xì)胞接種密度[2.9×10~6個(gè)/mL(一組)、6.2×10~6個(gè)/mL(二組)與8.8×10~6個(gè)/mL(三組)],共3個(gè)處理組,每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù),共培養(yǎng)4天。結(jié)果表明:1)剛分離的十二指腸上皮細(xì)胞團(tuán)呈球形,且細(xì)胞團(tuán)的大小均一,懸浮于培養(yǎng)液中,貼壁后細(xì)胞團(tuán)開(kāi)始向外伸展,逐漸鋪成片,細(xì)胞之間界限清晰、貼壁均勻,呈單層“鋪路石樣”生長(zhǎng);2)經(jīng)堿性磷酸酶染色,陽(yáng)性處理組的十二指腸上皮細(xì)胞胞漿被染成了藍(lán)黑色,陰性對(duì)照組的十二指腸上皮細(xì)胞不著色,本試驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞均為十二指腸上皮細(xì)胞;3)在細(xì)胞培養(yǎng)的48和72 h,一組和二組細(xì)胞的跨膜電阻(Transepithelial Electrical Resistance,TEER)值(分別為:458、467Ω·cm~2(一組),411、380Ω·cm~2(二組))均滿足大于300Ω·cm~2的試驗(yàn)要求,酚紅透過(guò)率(分別為:2.20、1.19%(一組),3.09、1.81%(二組))均滿足小于5%的試驗(yàn)要求,并且一組的跨膜電阻TEER值均顯著大于其它兩組(P0.03),細(xì)胞酚紅透過(guò)率均顯著小于其它兩組(P0.002);4)在細(xì)胞培養(yǎng)的24和48 h,一組的LDH酶活力較其他兩組均維持在較低水平(P0.0001)。以上結(jié)果表明,細(xì)胞接種密度為2.9×10~6個(gè)/mL與培養(yǎng)時(shí)間為48h時(shí),細(xì)胞間界限清晰、生長(zhǎng)狀態(tài)良好、緊密連接性強(qiáng),細(xì)胞活力最佳,即表明原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞物質(zhì)吸收模型構(gòu)建成功,為后續(xù)磷在十二指腸上皮細(xì)胞的吸收規(guī)律及其分子機(jī)制的研究提供了良好的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｔ囼?yàn)二研究不同磷孵育時(shí)間下原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收規(guī)律,根據(jù)磷的吸收與孵育時(shí)間的曲線關(guān)系以確定細(xì)胞最佳孵育時(shí)間,為在細(xì)胞最敏感的狀態(tài)下研究磷的吸收提供試驗(yàn)依據(jù)。該研究采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)8個(gè)磷孵育時(shí)間點(diǎn)(0、10、20、40、60、80、100和120 min),共8個(gè)處理組,每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明:在細(xì)胞進(jìn)行磷孵育不同時(shí)間點(diǎn),十二指腸上皮細(xì)胞的磷吸收率存在顯著差異(P0.0001)。在孵育時(shí)間0-80 min之間,細(xì)胞磷吸收率隨著磷孵育時(shí)間的增加而線性增加,在這一線性增加的時(shí)間范圍內(nèi),選擇中間位置時(shí)間點(diǎn)40 min作為研究不同孵育濃度下細(xì)胞磷吸收動(dòng)力學(xué)規(guī)律的最佳孵育時(shí)間;用二次曲線、漸近線、斷線三種曲線擬合的方法對(duì)磷吸收率數(shù)據(jù)擬合相應(yīng)的曲線模型發(fā)現(xiàn),以漸近線法擬合曲線模型的擬合度最好,因此選用漸近線擬合模型求出的磷吸收率達(dá)到飽和的時(shí)間點(diǎn)為87min,作為研究不同磷孵育濃度下細(xì)胞磷吸收相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的分子機(jī)制的最佳孵育時(shí)間。試驗(yàn)三在試驗(yàn)二確定最佳孵育時(shí)間的基礎(chǔ)上,研究不同磷孵育濃度下磷在原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞中的動(dòng)力學(xué)吸收規(guī)律及其對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響。該研究采用單因子的完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)8個(gè)磷水平0.0、0.75、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0和48.0 mmol/L的含磷孵育液,共8個(gè)處理組,每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù),在孵育時(shí)間40 min時(shí)研究不同磷孵育濃度下細(xì)胞中磷吸收動(dòng)力學(xué)規(guī)律,在孵育時(shí)間87 min時(shí)研究不同磷孵育濃度(0.0、6.0和48.0 mmol/L)下磷相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的分子機(jī)制。結(jié)果表明:1)在不同的磷孵育水平下,肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞磷吸收率呈線性或曲線顯著增加(P0.0001),并且原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞對(duì)磷的吸收動(dòng)力學(xué)規(guī)律最適合飽和載體轉(zhuǎn)運(yùn)加非飽和擴(kuò)散模型;2)孵育液中添加磷(6.0 mmol/L)顯著抑制(P0.04)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞中NaP-Ⅱb mRNA表達(dá),顯著促進(jìn)(P0.0001)細(xì)胞中PiT-2 mRNA表達(dá),而對(duì)PiT-1 mRNA表達(dá)及NaP-Ⅱb、PiT-1、PiT-2蛋白的表達(dá)沒(méi)有顯著影響(P0.15);3)孵育液中添加磷(48.0 mmol/L)顯著抑制(P0.04)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞中NaP-Ⅱb、PiT-1的mRNA和蛋白表達(dá),顯著促進(jìn)(P0.0001)細(xì)胞中PiT-2 mRNA的表達(dá),而對(duì)PiT-2蛋白的表達(dá)沒(méi)有顯著影響(P0.15)。以上結(jié)果表明,原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)磷的吸收符合飽和載體轉(zhuǎn)運(yùn)加非飽和擴(kuò)散模型。并且,當(dāng)孵育液中磷添加過(guò)量時(shí),原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞通過(guò)降低NaP-Ⅱb和PiT-1的mRNA及蛋白的表達(dá)而限制對(duì)磷的吸收。綜上所述,細(xì)胞密度約為3×10~6個(gè)/mL,在細(xì)胞培養(yǎng)的48 h,成功構(gòu)建原代培養(yǎng)肉雞雞胚十二指腸上皮細(xì)胞的物質(zhì)吸收模型;無(wú)機(jī)磷在原代培養(yǎng)十二指腸上皮細(xì)胞中的磷吸收方式以非飽和擴(kuò)散加飽和載體轉(zhuǎn)運(yùn)為主;當(dāng)孵育液中磷添加過(guò)量時(shí),細(xì)胞通過(guò)下調(diào)NaP-IIb、PiT-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平及上調(diào)PiT-2 mRNA的表達(dá),而限制對(duì)磷的吸收,這可能是細(xì)胞為了避免磷吸收過(guò)量而中毒的自我反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。
【圖文】：

從空轉(zhuǎn)運(yùn)體的重定位（8-1）獲得電性，并且在跨膜電場(chǎng)（1-2a）中結(jié)合1個(gè)Na賴性轉(zhuǎn)運(yùn)，但是這個(gè)過(guò)程只轉(zhuǎn)運(yùn)Na+不轉(zhuǎn)運(yùn)P；第二階段是不依賴于電壓的轉(zhuǎn)運(yùn)Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)體在細(xì)胞膜上移動(dòng)，結(jié)合第二個(gè)Na+，之后誘導(dǎo)磷與該轉(zhuǎn)運(yùn)體作用結(jié)合第三個(gè)Na+，此時(shí)，該轉(zhuǎn)運(yùn)載體一共負(fù)載三個(gè)Na+和一個(gè)磷酸根，NaP-II蛋，并實(shí)現(xiàn)向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，最終在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)將三個(gè)Na+和一個(gè)磷酸根釋放，a+- Na+-Pi- Na+的先后結(jié)合順序，是逆電中性的過(guò)程。NaP-IIc被發(fā)現(xiàn)主要在小鼠腎臟對(duì)磷的重吸收（Segawa 等，2002）。III 型鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)載體包括兩種，載體1（Inorganic Phosphate Transporter1，，PiT-1）和無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體2（Inorganicter 2，PiT-2），主要在鼠小腸的刷狀緣膜和隱窩/絨毛軸上皮細(xì)胞以及神經(jīng)元、，維持細(xì)胞磷的轉(zhuǎn)運(yùn)、及體內(nèi)磷穩(wěn)態(tài)（Collins 等，2004； Inden 等，2013），1 在十二指腸頂膜上表達(dá)（Giral 等，2009）。另外，還在磷誘導(dǎo)的小鼠血管平揮了重要作用（Li 等，2006；Dai 等，2013），并發(fā)現(xiàn)PiT-2 也參與在這amel 等，2013）。并且，PiT-1和PiT-2已被證實(shí)具有保守性的磷轉(zhuǎn)運(yùn)功能，參與胞礦化等（B ttger和Pedersen，2005）。III 型鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)載體在腸道轉(zhuǎn)運(yùn)磷（Virkki 等，2007），在先后結(jié)合Na+和P時(shí)既有序又隨機(jī)，是一個(gè)混合型的合Na+也可以先結(jié)合P，最終該轉(zhuǎn)運(yùn)載體共結(jié)合兩個(gè)Na+和一個(gè)磷，從而發(fā)生電細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)將兩個(gè)Na+和一個(gè)磷酸根釋放。

圖1-2 NaP-III轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)磷的機(jī)制（Virkki 等，2007）ure 1-2 The transport mechanism of type III sodium-dependent phosphate transporters（Virkki 等鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)載體在雞上的研究已有一些報(bào)道。研究表明，NaP-IIb主要在雞A 表達(dá)水平在十二指腸最高（Han 等，2009；Fang 等，2012；劉松柏，20有利于促進(jìn)肉仔雞十二指腸NaP-IIb mRNA表達(dá)（Liu 等，2016）。Nie 等（20指腸NaP-Ⅱb mRNA表達(dá)水平隨著飼糧中非植酸磷水平的升高而降低。本實(shí)驗(yàn)采用自然飼喂法研究報(bào)道，NaP-IIb mRNA主要在肉雞十二指腸表達(dá)，而Pi要在其回腸表達(dá)；飼糧低磷水平可促進(jìn)肉雞十二指腸NaP-IIb和PiT-1 mRNA 的2 mRNA表達(dá)。然而，Bai 等（2000）報(bào)道，PiT-2 蛋白在小鼠空腸表達(dá)最高。在肉仔雞小腸中的吸收規(guī)律及其分子機(jī)制的研究結(jié)果表明，十二指腸是肉仔雞aP-IIb mRNA 表達(dá)的主要部位，并且無(wú)機(jī)磷在肉仔雞十二指腸中的吸收以飽和（劉松柏，2012；Liu 等，2016），飼糧無(wú)機(jī)磷可通過(guò)上調(diào)肉仔雞十二指腸NaP-I水平并降低PiT-1 蛋白表達(dá)水平，而促進(jìn)肉仔雞小腸對(duì)磷的吸收（Hu 等，20道磷吸收的主要部位是肉雞等畜禽吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所，其中無(wú)機(jī)磷在整個(gè)小腸均可以被吸收
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S831.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2697034