發(fā)布時間：2020-06-04 21:44

【摘要】：煙草青枯病是由茄青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的帶有土壤傳播特性的病害,導致煙草青枯病癥的發(fā)生,青枯病菌可以在土壤里或者病殘體里越冬,殘留的病菌會繼續(xù)危害煙草的生產(chǎn)。青枯病為細菌性維管束病害,運用傳統(tǒng)的病害防治方法可以綜合防治和控制青枯病的爆發(fā),但是會耗費大量的人力物力資源,而且化學防治往往還伴隨著環(huán)境污染以及致病菌耐藥性的問題,另外,青枯病害一旦大規(guī)模爆發(fā),幾乎沒有有效的救治手段。因此,開發(fā)具有青枯病耐受性并能穩(wěn)定遺傳的煙草種質(zhì)資源有著切實的應用價值。雜交育種是常規(guī)的育種方式,但是在煙草防治青枯病上,缺乏明確的抗原,而在誘變育種方式中,誘發(fā)突變的方向難以掌握,有效耐受青枯病害的突變體煙草植株難以獲得。通過轉基因育種的方法,可以快速地在煙草基因組中整合有益的目的基因,使煙草獲得對青枯病的高抗性。不僅如此,青枯病菌侵害的寄主十分廣泛,其中包含有重要的經(jīng)濟作物、蔬菜和糧食,病害同樣會造成這些寄主嚴重的作物減產(chǎn)以及經(jīng)濟損失等問題。通過轉基因煙草對青枯病耐受性的研究,明確在植物體內(nèi)異源表達的待選基因對青枯菌的抑制能力,同樣能指導其它重要經(jīng)濟作物等的轉基因抗青枯病材料的研發(fā)。刺肩蝽的抗菌肽死亡素Thanatin,是具有β-折疊結構的最小的昆蟲抗菌肽,僅有21個氨基酸殘基,其分子量小、抗菌譜廣和高效性成為了理想的轉基因肽的備選基因。有研究表明,番茄(Solanum lycopersicum)中轉入抗菌肽CecB基因,轉基因株系獲得了對青枯病的耐受力;水稻和擬南芥異源表達Thanatin,分別獲得了抗稻瘟病的水稻以及對真菌抗性提高的擬南芥葉片。這些抗性轉基因材料的研發(fā),為植物抗病性的研究提供了理論依據(jù)。本研究將帶有分泌肽(SP)編碼序列的Thanatin基因由CaMV 35S啟動子控制,經(jīng)農(nóng)桿菌介導轉化裸莖煙草,獲得整合有Thanatin的轉基因植株,分析T1代植株Thanatin基因的表達水平,煙草植株通過傷根澆灌法接種青枯菌,分析煙草病害指數(shù)、葉片葉綠素含量變化以及分離培養(yǎng)根莖結合部位組織,探討外源Thanatin對轉基因植株的青枯病耐受性的影響,為轉基因抗青枯病煙草的培育和研究提供理論依據(jù)。主要研究結果如下:1、構建了含有2x35S::spThanatin基因的雙元表達載體將公司合成的融合有煙草PR-1基因分泌信號肽Sp編碼序列的刺肩蝽抗菌肽Thanatin基因spThanatin與CaMV 35S啟動子相連,構建了含有2x35S::spThanatin基因的雙元表達載體pVCT2365p5。2、獲得了煙草轉基因T1代植株并明確了Thanatin基因的表達水平通過農(nóng)桿菌介導法,利用LBA4404(pVCT2365p5)轉化煙草葉片外植體,在含卡那霉素(Kan)的煙草分化培養(yǎng)基中進行分化篩選,獲得了具有Kan抗性的組培苗9株,再通過PCR檢測組培苗中的thanatin基因,篩選出了轉thanatin基因的陽性植株L4、L5、L7、L8和L9。PCR擴增篩選出每個株系T1代群體中的陽性單株,隨機剪取每個株系內(nèi)的三個陽性植株葉片,混樣提取RNA,反轉錄合成單鏈cDNA;通過SYBR GREEN qRT-PCR檢測和分析thanatin基因的表達量,以T1代株系L5的表達量為基準數(shù)1,T1代株系L4、L7、L8、L9相較于T1代株系L5分別有3、3.2、25.6、4.5倍的相對表達水平。3、Thanatin基因異源表達增強了轉基因煙草對青枯病的耐受性L4、L5、L8轉基因煙草株系和WT野生型煙草通過傷根澆灌法活體接種青枯菌,煙草青枯病病害早期階段,植株葉片的萎焉是可逆的并且不伴隨葉綠素含量的變化,隨著病害進程的加重,植株葉片變?yōu)辄S褐色枯萎狀,葉片病害部位由葉柄開始,從葉脈向四周擴散;分離接種處理后的L8株系及WT野生型煙草根莖結合部組織,表面消毒后縱切,縱切面涂布于TTC培養(yǎng)基上均能長出紅色菌落,表明青枯成功感染植株,并在植株體內(nèi)繁殖擴散。L4、L5株系和WT煙草有相近似的病害指數(shù)數(shù)值,L8株系在各個處理中的時期,有明顯低于其它三個株系的病害指數(shù);從病害指數(shù)趨勢上分析,L8株系相較于其它三個處理株系,可以在青枯菌接種早期抑制病菌的繁殖,延緩青枯病的病發(fā),延長煙草的存活時間,說明相對表達水平較高的thanatin基因提高了煙草植株對青枯病的耐受性,表明了thanatin基因較強異源表達增強了轉基因煙草對青枯病的耐受性。
【圖文】：

圖 1-1 抗菌肽經(jīng)典的作用機制。Fig. 1-1. The classic action mechanism of antibacterial peptide .幾十年的研究已經(jīng)積累了大量關于 AMP 的信息，這些信息可以在 AMP 數(shù)據(jù)庫中管理和查詢[4]。隨著新的 AMPs 被發(fā)現(xiàn)，這些數(shù)據(jù)庫還會得到進一步擴展�？咕臄�(shù)據(jù)庫(APD3)包含 2,169 個抗菌、172 個抗病毒、105 個抗艾滋病病毒、959 個抗真菌、80 個抗寄生蟲和 185 個抗癌肽[4]。在抗菌的抗菌肽中，大多數(shù)是來源于細菌的細菌肽，，而其他的則來自古細菌、原生生物、真菌、植物和動物[4]。ADAM(抗微生物肽數(shù)據(jù)庫)是另一個有用的 AMP 數(shù)據(jù)庫，包含 7,007 個獨特的序列和 759 個結構。CAMP R3(抗微生物肽的收集)數(shù)據(jù)庫可以查詢 AMP 序列及其命名[17]。1.2.2 抗菌肽的潛在作用價值目前為止，超過 1700 中天然抗菌肽已被鑒別，通過天然抗菌肽作為模板，數(shù)千種衍生物和類似物已被電腦設計、合成[18]。網(wǎng)站資源和數(shù)據(jù)庫提供大量關于天然及合成抗菌肽的信息（表 1-1）。這些資源和數(shù)據(jù)庫提供方便的搜索工具來搜索期望的特質(zhì)，提供多種分析和預測工具，并且?guī)徒M促進提高醫(yī)療指數(shù)或者抗菌特質(zhì)的新型抗菌肽的發(fā)現(xiàn)

4.1.1.1 中間載體 pVCT1404p1 的 PCR 鑒定及酶切鑒定回收 pVCT1398p1 和 pVCT2405p1 酶切 365bp 和 7515bp 的目的片段（圖 4-2A、4經(jīng) T4DNA 連接酶連接后轉化，從平板上隨機挑選數(shù)個克隆，用引物 p240p257B 進行篩選得到 819bp 預期大小的片段（圖 4-2C）。挑取菌落 PCR 擴增初步篩選的陽性克菌提取質(zhì)粒，進行 NcoI 酶切鑒定，獲得 5336bp+2544 預期大小的片段（圖 4-2D）落 PCR 擴增鑒定和酶切鑒定后，表明中間載體 pVCT1404p1 構建成功。182028DABDMb 123 4 M M 2930365bp7515bpM 5 6 7 8 91011 1213 14 15 16 1719 21 222324252627
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S435.72

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本文編號：2697017