【摘要】：第一部分Laron綜合征患者臨床特點(diǎn)總結(jié)目的:總結(jié)Laron綜合征患者的臨床特點(diǎn)及基因檢測(cè)結(jié)果,并比較不同種族Laron綜合征患者的臨床特點(diǎn)。研究對(duì)象和方法:1.收集臨床資料:收集2012年至2017年就診于我院內(nèi)分泌科的Laron綜合征患者的臨床資料及血清學(xué)檢查結(jié)果,包括血常規(guī)、肝腎功、甲狀腺功能、血清GH和IGF-1水平。每個(gè)患者分別進(jìn)行2項(xiàng)生長(zhǎng)激素激發(fā)實(shí)驗(yàn),分別于用藥前及用藥后30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘采集外周血清測(cè)定GH濃度。影像學(xué)檢查包括鞍區(qū)核磁及左手腕關(guān)節(jié)骨齡相。2.采集外周全血進(jìn)行GHR基因外顯子測(cè)序:簽署知情同意書(shū)后,采集患者及家屬外周全血標(biāo)本,提取外周血白細(xì)胞DNA,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GHR基因,測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì),運(yùn)用軟件對(duì)新發(fā)突變進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。3.系統(tǒng)綜述:在Pubmed、萬(wàn)方、知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)中分別運(yùn)用英文和中文關(guān)鍵詞“Laron syndrome”,、“growth hormone insensitivity”,、“Laron-type dwarfism”.“growth hormone resistance syndrome”、“Laron綜合征”、“生長(zhǎng)激素不敏感綜合征”、“Laron型侏儒”、“生長(zhǎng)激素抵抗”檢索文獻(xiàn),正文內(nèi)對(duì)每個(gè)患者的臨床資料都有描述的文獻(xiàn)予以納入。結(jié)果:1.臨床資料:共納入4例Laron綜合征患者,均為男性,平均起病年齡為2.5歲(1.0歲-6.0歲),平均診斷年齡為7.6歲(3.5歲-14.3歲),在起病平均5.1年后,獲得明確診斷�；颊呱砀逽DS中位數(shù)為-4.73(-6.71～-2.80),體重SDS中位數(shù)為-2.58(-2.96～-1.82),身高落后較體重落后更為顯著�；颊�4具有Laron綜合征的典型面容(前額突出、鼻梁塌陷、中面部發(fā)育不良),其余3例患者面容無(wú)明顯異常。4例Laron綜合征患者GH基礎(chǔ)值分別為15.44ng/ml、2.1Ong/ml、9.60ng/ml和1.59ng/ml(正常范圍:2.0Ong/ml),GH激發(fā)實(shí)驗(yàn)后峰值分別為23.36ng/ml、31.70ng/ml和33.80ng/ml,患者2未行GH激發(fā)試驗(yàn)�；颊�1血清IGF-1濃度為32ng/ml,其余3例均低于檢測(cè)范圍下限(25ng/ml)。所有患者均存在骨齡延遲,分別較實(shí)際年齡落后12個(gè)月、6個(gè)月、28個(gè)月和24個(gè)月,患者骨齡較實(shí)際年齡平均延遲17.5個(gè)月。4例患者中患者1和患者4接受過(guò)rhGH治療,患者1治療劑量為0.053 mg/kg/d,共治療2月,治療后身高增加3.30cm�；颊�4治療劑量為0.057mg/kg/d,共治療10月,治療后血清IGF-1水平仍然小于25ng/ml,治療后身高增加5.75cm。2.GHR基因外顯子測(cè)序:4例患者中共發(fā)現(xiàn)5種SNP位點(diǎn),分別為c.1483CA(p.P495T)和c.1630AC(p.I544L)(患者 1);c.558AG(p.G186G)、c.1319GT(p.C440F)和c.1735(p.P579T)(患者2)。1個(gè)基因突變位點(diǎn)既往有過(guò)報(bào)道,此位點(diǎn)為c.587AC(p.Y196S)(患者4)。此外,患者2-4各發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的突變位點(diǎn),分別為c.808AG(p.I270V)(患者 2)、c.766CT(p.Q256X)(患者 3)和c.1707-171 Ode1(p.E570fs)(患者4)。軟件功能預(yù)測(cè)結(jié)果提示p.I270V為良性變異,p.Q256X和p.E570fs為致病性突變。3.中國(guó)Laron綜合征患者臨床特點(diǎn):文獻(xiàn)報(bào)道中國(guó)Laron綜合征患者共計(jì)35名(含本研究4例),男女比例為27:8(3.4:1),平均年齡為9.1±3.4歲(2.2歲-15.0歲),中位身高SDS為-4.40(Q1,Q3:-5.90,-2.67)。生長(zhǎng)激素激發(fā)實(shí)驗(yàn)后中位GH峰值為 17.01 ng/ml(Q1,Q3:14.56,33.20)。IGF-1 SDS平均值為-2.65±0.55(N=23),IGFBP-3 SDS平均值為-1.82±1.16(N=17)。共有13名患者具有GHR基因突變,共計(jì)10種突變類型,不同突變類型的患者之間身高無(wú)明顯差異。3名患者發(fā)現(xiàn)IGFALS基因突變,身高缺陷較輕,身高SDS中位數(shù)為-2.66。4.不同種族之間Laron綜合征患者臨床特點(diǎn)的比較:比較13名土耳其患者、9名印度患者、35名歐洲患者和35名中國(guó)患者的臨床特點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國(guó)患者的診斷年齡明顯晚于歐洲患者,中位診斷年齡中國(guó)患者為9.0歲,歐洲患者為5.7歲(P=0.004)。土耳其患者身高缺陷較中國(guó)患者更為嚴(yán)重,二者身高SDS分別為-7.4和-4.4(P=0.001)。土耳其患者生長(zhǎng)激素激發(fā)試驗(yàn)后GH峰值明顯高于歐洲和中國(guó)患者(P值分別為0.003和0.000)。結(jié)論:1.Laron綜合征是一類罕見(jiàn)的導(dǎo)致矮小的遺傳性疾病,本研究收集的4例患者,3例發(fā)現(xiàn)有GHR基因的新突變位點(diǎn)。患者臨床表現(xiàn)異質(zhì)性較大,GH基礎(chǔ)值和GH激發(fā)試驗(yàn)GH峰值都增高,但是IGF-1均較低。部分患者對(duì)rhGH治療有一定反應(yīng)性。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,越來(lái)越多的患者可以獲得明確的遺傳學(xué)診斷。2.在土耳其、印度、歐洲和中國(guó)患者中,中國(guó)患者診斷年齡最晚,土耳其患者身材矮小最嚴(yán)重,GH激發(fā)實(shí)驗(yàn)后GH峰值最高。第二部分GHR基因突變的細(xì)胞學(xué)功能研究目的:對(duì)臨床發(fā)現(xiàn)的GHR基因新發(fā)突變位點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)水平的功能研究。方法:構(gòu)建表達(dá)GHR基因的野生型及3種突變型的質(zhì)粒載體(pcDNA3.1-GHR-WT、pcDNA3.1-GHR-Y196S、pcDNA3.1-GHR-Q256X、pcDNA3.1-GHR-E570fs)。采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,將野生型和突變型GHR質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)人胚腎HEK293T細(xì)胞及人肝癌HepG2細(xì)胞。48小時(shí)后,采用蛋白免疫印跡法(Westernblot,WB),檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GHR蛋白的表達(dá)情況。采用免疫熒光染色法,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)GHR蛋白的分布情況。100ng/ml rhGH作用于轉(zhuǎn)染野生型及3種突變型GHR表達(dá)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞30分鐘后,采用WB方法,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化STAT5蛋白的表達(dá)情況。l00ng/ml rhGH作用于轉(zhuǎn)染野生型及3種突變型GHR表達(dá)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞24小時(shí)后,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)法,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IGF1基因mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量;同時(shí)留取細(xì)胞培養(yǎng)液,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IGF-1蛋白的濃度。結(jié)果:1.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)GHR蛋白的表達(dá)量:分別轉(zhuǎn)染野生型及3種突變型GHR表達(dá)質(zhì)粒于HEK293T細(xì)胞和HepG2細(xì)胞后,采用抗HA標(biāo)簽的抗體進(jìn)行WB檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),野生型GHR和Y196S突變型GHR蛋白,均在分子量為130kDa處有一明顯的條帶,但是野生型GHR蛋白表達(dá)量較Y196S突變型GHR蛋白的表達(dá)量高28.9%,差異具有顯著性(P0.05)。Q256X突變型由于產(chǎn)生截短蛋白,因此在分子量為43kDa處出現(xiàn)特異性條帶,而且其表達(dá)量較野生型GHR蛋白減少47.0%(P0.05)。E570fs突變是4個(gè)堿基缺失導(dǎo)致的移碼突變,在上述130kDa、43kDa以及其它低分子量處,均未檢測(cè)到特異性條帶。采用抗GHR的特異性抗體進(jìn)行WB檢測(cè),也獲得了相似的結(jié)果。2. GHR蛋白免疫熒光染色:轉(zhuǎn)染野生型和3種不同突變型GHR表達(dá)質(zhì)粒48小時(shí)后,固定細(xì)胞,采用抗HA標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫熒光染色,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),在HEK293T細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中,野生型GHR蛋白在細(xì)胞膜表面均勻分布,Y196S突變型GHR蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布模式與野生型類似,均勻分布在細(xì)胞膜上;Q256X和E570fs突變型GHR蛋白與野生型GHR蛋白分布模式不同,突變型GHR蛋白在細(xì)胞漿內(nèi)圍繞細(xì)胞核呈“戒指狀”分布,在胞漿內(nèi)細(xì)胞核一側(cè)有局限性的綠色熒光濃聚。3.轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞中磷酸化STAT5的表達(dá)量:在轉(zhuǎn)染野生型和3種突變型GHR表達(dá)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中,加入lOOng/mlrhGH作用30分鐘后,采用抗磷酸化的STAT5抗體進(jìn)行WB檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染Y196S、Q256X和E570fs突變型GHR質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中,磷酸化STAT5的表達(dá)量顯著下降,分別降低了32.7%、40.6%和29.6%(P0.05)。4. rhGH作用后HepG2中IGF1基因mRNA的表達(dá)量:轉(zhuǎn)染野生型和3種突變型質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞,加入100ng/ml rhGH作用24小時(shí)后,采用qRT-PCR法檢測(cè)IGFlmRNA的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與轉(zhuǎn)染野生型GHR質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞相比轉(zhuǎn)染Y196S和Q256X突變型GHR質(zhì)粒細(xì)胞的IGFlmRNA表達(dá)量無(wú)明顯減少,但是轉(zhuǎn)染E570fs突變型GHR質(zhì)粒的細(xì)胞,IGF1 mRNA表達(dá)量卻較野生型明顯增高,增氋了64.1%(PC0.05)。5. rhGH作用后HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中IGF-1蛋白的濃度:在轉(zhuǎn)染野生型和3種突變型質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中加入lOOng/mlrhGH,作用24小時(shí)后,采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IGF-1的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染野生型GHR質(zhì)粒的細(xì)胞培養(yǎng)中,IGF的濃度為71.88 pg/ml,轉(zhuǎn)染3種突變型GHR質(zhì)粒的IGF-1濃度分別為94.80pg/ml,95.63 pg/ml和95.63 pg/ml,各組之間IGF-1蛋白濃度無(wú)顯著差異(P=0.238)。結(jié)論:1.Y196S突變型GHR蛋白表達(dá)量較野生型GHR明顯降低,其在細(xì)胞中的分布和野生型沒(méi)有明顯差異,但是其激活GH受體后信號(hào)通路上STAT5的能力減低。2.Q256X突變后產(chǎn)生分子量約43kDa的截短蛋白,其表達(dá)量明顯低于野生型GHR,Q256X突變型蛋白滯留于細(xì)胞質(zhì)中,對(duì)STAT5信號(hào)分子的激活能力明顯減弱。3.E570fs突變型GHR蛋白分子量大小未知,其蛋白滯留于細(xì)胞質(zhì)中,對(duì)STAT5信號(hào)分子的激活能力減弱。
【圖文】：

一，ｃ．８０８Ａ＞Ｇｐ．Ｉ７０Ｖ、ｃ．７６６Ｃ＞Ｔｐ．Ｑ５６Ｘ．邋１７０７－１７１邋Ｏｄｅｌ邋（ｐ．Ｅ５７０ｆｓ）。逡逑患者１檢測(cè)出ＧＨＲ基因的復(fù)合雜合變異，均位于第１０外顯子上（Ｐ４９５Ｔ５４４Ｌ，圖邋１－１）0逡逑Ａ＊邋■？？＊？？？？邋？邐．邋．邋Ｖ邋？邋？邋？邋■邋？邋■邋Ｑ邋＇邐！邐＊邐！邐？邐：邐？邐！邐！邋ｆ邋！逡逑１邐５：逡逑

患者４含有兩個(gè)復(fù)合雜合突變位點(diǎn)，分別為Ｙ１９６Ｓ和Ｅ５７０ｆｓ，，其中Ｙ１９６Ｓ突逡逑變來(lái)自于母親，是一個(gè)錯(cuò)義突變；Ｅ５７０ｆｓ突變來(lái)自于父親，由于連續(xù)缺失了邋４個(gè)堿逡逑基，造成密碼子的閱讀框發(fā)生改變（圖１－５）。逡逑Ａ＊邐？邐？邐■邐．邐Ｄ邋＇邐■？？？＊－－邐逡逑３邋ｉ邋Ｓ邋３邋Ｓ邋３邐３邐：邋Ｓ逡逑ｔ逡逑Ｊｈ邋Ｉ邋ｉ邋｜｜邋＾邐—逡逑Ｅｘｏｎ邋６邋ｃ．５８７Ａ＞邋Ｃ邐Ｅｘｏｎ邋１０邋ｃ．１７０７－１７１邋Ｏｄｅｌ逡逑ｃ邋１邋□￣￣ｒ－0逡逑ｎ邋ｒ逡逑圖１－５患者４基因檢測(cè)結(jié)果（Ａ、Ｂ）和家系圖（Ｃ）。逡逑注：男性致病基因攜帶者，Ｑ女性致病基因攜帶者，先證者逡逑分別用在線軟件對(duì)上述新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，以初步判斷突變是否逡逑會(huì)影響基因的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ－２和Ｍｕｔａｔｉｏｎ邋Ｔａｓｔｅｒ軟件預(yù)測(cè)Ｉ２７０Ｖ逡逑突變?yōu)榱夹宰儺悾唬停酰簦幔簦椋铮铄澹裕幔螅簦澹蝾A(yù)測(cè)Ｑ２５６Ｘ和Ｅ５７０ｆｓ突變均為致病突變（表１－６）。逡逑２２逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R725.8

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8 周

本文編號(hào)：2695008