【摘要】：草莓(Fragaria×ananassa Duch.)屬薔薇科草莓屬草本植物。草莓含有大量的黃酮類物質(zhì),這些物質(zhì)不僅使其色澤鮮艷,還具有多種保健功能,因而草莓備受消費(fèi)者青睞�；ㄇ嗨睾驮ㄇ嗨囟际欠浅Ｖ匾狞S酮類物質(zhì),它們均具有較強(qiáng)的抗氧化作用,可以幫助人體抗衰老、預(yù)防癌癥和抵御心血管疾病等�；ㄇ嗨剡�是天然的水溶性色素,大部分被子植物果實(shí)和花的顏色都是由花青素決定的。二氫黃酮醇-4-還原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)是花青素和原花青素合成途徑中非常關(guān)鍵的酶,可催化3種二氫黃酮醇和兩種黃烷酮生成5種不同的花青素前體。這些不同的花青素對(duì)植物組織和器官產(chǎn)生豐富的顏色十分重要。而原花青素是一種花青素(矢車菊素)的還原產(chǎn)物形成的單倍體或聚合體。因此DFR對(duì)花青素和原花青素的形成均十分重要。本研究通過對(duì)草莓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)藍(lán)光和白光下差異表達(dá)的DFR基因,并且藍(lán)光處理下花青素的含量較白光處理明顯增多。此DFR與NCBI中已經(jīng)登錄的草莓DFR基因序列差異明顯。研究該基因的功能對(duì)深入理解DFR基因家族的功能具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)通過克隆得到此DFR基因的CDS區(qū)以及啟動(dòng)子序列,利用qRT-PCR測(cè)定該基因在草莓中的時(shí)空表達(dá),并通過原核表達(dá)獲得DFR重組蛋白進(jìn)行體外酶催化實(shí)驗(yàn)和擬南芥體內(nèi)過表達(dá)此DFR,雙向驗(yàn)證該基因的功能。獲得的主要結(jié)果如下:(1)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)對(duì)DFR基因克隆,獲得了一條長(zhǎng)1065 bp的DFR序列,將其命名為FaDFRL,該序列編碼的氨基酸與草莓中其他FaDFR編碼的氨基酸序列相似性僅35%。FaDFRL具有DFR基因家族典型的NADPH結(jié)合域和底物結(jié)合區(qū)。在線預(yù)測(cè)FaDFRL啟動(dòng)子的功能發(fā)現(xiàn),該啟動(dòng)子中有多個(gè)光響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件。(2)FaDFRL基因在藍(lán)光處理下花后14 d的草莓果實(shí)中表達(dá)量顯著高于其他處理,在紅光處理花后25 d的草莓果實(shí)中其表達(dá)量也顯著高于其他處理。表明FaDFRL在褪綠期受藍(lán)光誘導(dǎo),在成熟期受紅光誘導(dǎo)。(3)通過原核表達(dá)獲取FaDFRL蛋白酶,并使用HPLC檢測(cè)該蛋白酶的功能發(fā)現(xiàn),FaDFRL蛋白酶對(duì)草莓中主要存在的兩個(gè)底物二氫山柰酚和二氫槲皮素均沒有催化作用。通過構(gòu)建過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入擬南芥獲得了T3代純合轉(zhuǎn)FaDFRL基因株系。經(jīng)qRT-PCR鑒定,該基因在擬南芥中過表達(dá)成功,然而擬南芥中花青素和原花青素的含量相對(duì)于野生型均沒有明顯提升。但因擬南芥中花青素含量極低,不太適用花青素相關(guān)研究。因此需要將FaDFRL基因轉(zhuǎn)入草莓中進(jìn)一步確認(rèn)其功能。此外,轉(zhuǎn)基因擬南芥受藍(lán)光照射后FaDFRL的表達(dá)量明顯降低,推測(cè)藍(lán)光對(duì)FaDFRL的調(diào)控為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。且根據(jù)前人的研究推測(cè),FaDFRL基因可能與植物的抗逆性相關(guān)。
【圖文】：

四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士學(xué)位論文牛中卻產(chǎn)生了磚紅色矮牽�；āＲ虼�，DFR 對(duì)底物的選擇是決定著植物中花色苷的種類的重要因素并在很大程度上決定花色苷的比例。使植物最終呈不同的顏色。此外有研究發(fā)現(xiàn) DFR 還可作為黃烷酮 4-還原酶（flavanone 4-reductase，F(xiàn)NR），催化柚皮素和圣草酚生成黃烷-4-醇（flavan-4-ols），，進(jìn)而在其他酶的作用下形成 3-脫氧花青素（3-deoxyanthocyanidin），這不僅使植物呈現(xiàn)出橙紅色（圖 1），而且 3-脫氧花青素及其中間代謝產(chǎn)物五羥基黃酮（luteoforol）還可作為防御物質(zhì)抵御真菌和細(xì)菌侵害[21-23]

組份名稱 用量Components Amount added10x Buffer 2.1 5 μLNco I 1 μLEcoR I 1 μL目的基因/pET-32a+1 μgddH2O 補(bǔ)足至 50 μL表 3 連接反應(yīng)體系Table 3 Connection system組份名稱 用量Components Amount addedpET-32a+載體 1 μL目的基因 7 μLT4DNA 連接酶 1 μL10x T4DNA Buffer 1 μL
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S668.4

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