【摘要】：LEAFY COTYLEDON1(LEC1)是胚胎發(fā)育與種子成熟過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,可以調(diào)控胚胎發(fā)育,且使胚胎獲得抵抗干燥的能力,抑制種子的過早萌發(fā)。在擬南芥中AtLEC1已被深入研究,lec1突變體胚胎不耐受干燥,并表現(xiàn)出幾種成熟特異性基因的表達缺陷,其特點包括不耐受干燥的胚胎可在種子干燥前被救活并且不表現(xiàn)任何明顯的突變表型。LEC1的異位表達能夠激活FUS3,FUS3可促進ABA合成,引起ABA水平的增加。且ABA在植物生長發(fā)育中具有重要的作用,它不僅能調(diào)控種子成熟階段和萌發(fā)階段,其含量與植物的再生能力也有著密不可分的關(guān)系。研究結(jié)果表明,外源ABA可以提高繼代培養(yǎng)和分化培養(yǎng)中植物的再生率,內(nèi)源ABA的含量與愈傷組織形成植株的再生率呈正相關(guān)關(guān)系。本實驗室前期經(jīng)過同源克隆,克隆出GmLEC1-A、GmLEC1-B基因,本研究中,我們選取GmLEC1-A基因,對其進行亞細胞定位并對蛋白表達進行分析;分別對擬南芥和大豆進行遺傳轉(zhuǎn)化,用外源ABA對擬南芥轉(zhuǎn)化植株進行處理,并測定大豆轉(zhuǎn)化植株中ABA的含量且與對照進行對比,目的是明確GmLEC1-A基因的功能,并探究GmLEC1-A基因在大豆再生體系中所產(chǎn)生的作用;進而為了提高大豆再生率,利用基因工程手段對大豆進行改良,為建立高效、穩(wěn)固的大豆再生體系奠定良好的基礎(chǔ);最后,通過轉(zhuǎn)化植株的表型對GmLEC1-A基因的功能進行初步分析,進而使其在實際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用上發(fā)揮重要的作用。主要實驗結(jié)果如下:1.對GmLEC1-A基因進行亞細胞定位分析,結(jié)果表明GmLEC1-A基因定位在細胞核中。2.構(gòu)建pET-29b-GmLEC1-A重組載體,進行蛋白表達分析,結(jié)果表明GmLEC1-A蛋白大小為35kDa左右。3.進行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化,成功獲得3個T_3代過表達轉(zhuǎn)基因lec1/GmLEC1-A株系,將轉(zhuǎn)基因lec1/GmLEC1-A、野生型和干燥前被救活的lec1突變體擬南芥種植到0,1,2,3μM濃度ABA的MS培養(yǎng)基中,結(jié)果表明,在不含ABA的培養(yǎng)基中,過表達擬南芥的萌發(fā)率較低,而突變體與野生型擬南芥基本相同。隨著ABA濃度不斷增大,突變體擬南芥萌發(fā)率受ABA影響較小,而過表達擬南芥對ABA十分敏感,萌發(fā)率逐漸降低。4.進行大豆遺傳轉(zhuǎn)化,成功獲得4株T_2代轉(zhuǎn)基因大豆植株,對其進行表型分析、萌發(fā)分析、測定其ABA含量并且對簇生芽進行電鏡分析,結(jié)果表明,過表達大豆萌發(fā)與生長相對遲緩;在萌發(fā)前,對照組和過表達大豆種子的ABA含量均隨時間的推移而降低,但過表達大豆種子中的ABA含量顯著高于對照種子;過表達大豆簇生芽細胞分裂較快。5.構(gòu)建了酵母表達載體pGBKT7-GmLEC1-A,轉(zhuǎn)化酵母細胞,驗證了pGBKT7-GmLEC1-A不存在轉(zhuǎn)錄激活活性;構(gòu)建GmMAPK3酵母表達載體pGADT7-GmMAPK3,通過酵母雙雜交實驗,證實GmLEC1-A可以與GmMAPK3相互作用。
【圖文】：

3-1 pEarleyGate101-GmLEC1-A 載體圖e vector diagram of pEarleyGate101-GmL片法將重組載體瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片，注射ate101-GmLEC1-A-EYFP 表達融合蛋白的作為對照。如圖 3-2 顯示：pEarleyGatemLEC1-A 基因定位在細胞核中。

注：A 為葉綠體；B 為黃色熒光圖像；C 為白光圖像；D 為重合圖像圖3-2 GmLEC1-A的亞細胞定位Fig.3-2 Subcellular localization of GmLEC1-A3.2 GmLEC1-A 基因的蛋白表達含有重組載體 pET-29b-GmLEC1-A 的 BL21(DE3)菌液活化至 OD600=0.6 后，分別加入 0.0.5mM 的 IPTG，誘導(dǎo) 4.5h，經(jīng) SDS-PAGE 電泳檢測結(jié)果顯示，在 35kDa 左右處出現(xiàn)目的白如圖 3-3，，表明該蛋白已成功表達。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2

【參考文獻】

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1 樊可心;曹愛萍;張文婷;郝小軍;崔百明;;棉花G.LEC1A基因的克隆和鑒定[J];石河子大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年05期

2 孫丹;李宏博;李千;樸鐘云;;北五味子體細胞胚發(fā)生過程中內(nèi)源IAA、ABA和GA_3含量的動態(tài)變化[J];植物生理學(xué)報;2013年01期

3 葉興國;佘茂云;王軻;杜麗璞;徐惠君;;植物組織培養(yǎng)再生相關(guān)基因鑒定、克隆和應(yīng)用研究進展[J];作物學(xué)報;2012年02期

4 王永軍;劉德新;;大豆栽培技術(shù)的科技化[J];農(nóng)村實用科技信息;2011年05期

5 張茂迎;宗曉娟;李德全;;植物MAPK級聯(lián)途徑參與調(diào)控ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[J];生命科學(xué);2010年08期

6 蔣先平;程俊鋒;劉霓紅;;植物克隆工廠的設(shè)計與建造[J];農(nóng)業(yè)工程技術(shù)(溫室園藝);2008年07期

7 梁稱福;;植物組織培養(yǎng)研究進展與應(yīng)用概況[J];經(jīng)濟林研究;2005年04期

8 趙團結(jié),蓋鈞鎰;栽培大豆起源與演化研究進展[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2004年07期

9 王光明,劉保國,陳靜,任昌福;內(nèi)源激素ABA對水稻再生芽萌發(fā)的影響[J];西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;1997年04期

10 譚紅,李志東;植物激素脫落酸的研究與應(yīng)用[J];中國科學(xué)院院刊;1997年04期

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1 馬彥龍;大豆GmLEC2基因的克隆及再生功能的初步分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 李澤鋒;一個中國南方野生大豆基因組深度測序及其分析[D];浙江大學(xué);2012年

3 蘇玉曉;ABA在擬南芥體細胞胚胎發(fā)生過程中的功能研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

本文編號：2694076