發(fā)布時間：2020-06-03 01:23

【摘要】：LEAFY COTYLEDON1(LEC1)是胚胎發(fā)育與種子成熟過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,可以調(diào)控胚胎發(fā)育,且使胚胎獲得抵抗干燥的能力,抑制種子的過早萌發(fā)。在擬南芥中AtLEC1已被深入研究,lec1突變體胚胎不耐受干燥,并表現(xiàn)出幾種成熟特異性基因的表達(dá)缺陷,其特點(diǎn)包括不耐受干燥的胚胎可在種子干燥前被救活并且不表現(xiàn)任何明顯的突變表型。LEC1的異位表達(dá)能夠激活FUS3,FUS3可促進(jìn)ABA合成,引起ABA水平的增加。且ABA在植物生長發(fā)育中具有重要的作用,它不僅能調(diào)控種子成熟階段和萌發(fā)階段,其含量與植物的再生能力也有著密不可分的關(guān)系。研究結(jié)果表明,外源ABA可以提高繼代培養(yǎng)和分化培養(yǎng)中植物的再生率,內(nèi)源ABA的含量與愈傷組織形成植株的再生率呈正相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)過同源克隆,克隆出GmLEC1-A、GmLEC1-B基因,本研究中,我們選取GmLEC1-A基因,對其進(jìn)行亞細(xì)胞定位并對蛋白表達(dá)進(jìn)行分析;分別對擬南芥和大豆進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,用外源ABA對擬南芥轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行處理,并測定大豆轉(zhuǎn)化植株中ABA的含量且與對照進(jìn)行對比,目的是明確GmLEC1-A基因的功能,并探究GmLEC1-A基因在大豆再生體系中所產(chǎn)生的作用;進(jìn)而為了提高大豆再生率,利用基因工程手段對大豆進(jìn)行改良,為建立高效、穩(wěn)固的大豆再生體系奠定良好的基礎(chǔ);最后,通過轉(zhuǎn)化植株的表型對GmLEC1-A基因的功能進(jìn)行初步分析,進(jìn)而使其在實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用上發(fā)揮重要的作用。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.對GmLEC1-A基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,結(jié)果表明GmLEC1-A基因定位在細(xì)胞核中。2.構(gòu)建pET-29b-GmLEC1-A重組載體,進(jìn)行蛋白表達(dá)分析,結(jié)果表明GmLEC1-A蛋白大小為35kDa左右。3.進(jìn)行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化,成功獲得3個T_3代過表達(dá)轉(zhuǎn)基因lec1/GmLEC1-A株系,將轉(zhuǎn)基因lec1/GmLEC1-A、野生型和干燥前被救活的lec1突變體擬南芥種植到0,1,2,3μM濃度ABA的MS培養(yǎng)基中,結(jié)果表明,在不含ABA的培養(yǎng)基中,過表達(dá)擬南芥的萌發(fā)率較低,而突變體與野生型擬南芥基本相同。隨著ABA濃度不斷增大,突變體擬南芥萌發(fā)率受ABA影響較小,而過表達(dá)擬南芥對ABA十分敏感,萌發(fā)率逐漸降低。4.進(jìn)行大豆遺傳轉(zhuǎn)化,成功獲得4株T_2代轉(zhuǎn)基因大豆植株,對其進(jìn)行表型分析、萌發(fā)分析、測定其ABA含量并且對簇生芽進(jìn)行電鏡分析,結(jié)果表明,過表達(dá)大豆萌發(fā)與生長相對遲緩;在萌發(fā)前,對照組和過表達(dá)大豆種子的ABA含量均隨時間的推移而降低,但過表達(dá)大豆種子中的ABA含量顯著高于對照種子;過表達(dá)大豆簇生芽細(xì)胞分裂較快。5.構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pGBKT7-GmLEC1-A,轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞,驗(yàn)證了pGBKT7-GmLEC1-A不存在轉(zhuǎn)錄激活活性;構(gòu)建GmMAPK3酵母表達(dá)載體pGADT7-GmMAPK3,通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),證實(shí)GmLEC1-A可以與GmMAPK3相互作用。
【圖文】：

3-1 pEarleyGate101-GmLEC1-A 載體圖e vector diagram of pEarleyGate101-GmL片法將重組載體瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片，注射ate101-GmLEC1-A-EYFP 表達(dá)融合蛋白的作為對照。如圖 3-2 顯示：pEarleyGatemLEC1-A 基因定位在細(xì)胞核中。

注：A 為葉綠體；B 為黃色熒光圖像；C 為白光圖像；D 為重合圖像圖3-2 GmLEC1-A的亞細(xì)胞定位Fig.3-2 Subcellular localization of GmLEC1-A3.2 GmLEC1-A 基因的蛋白表達(dá)含有重組載體 pET-29b-GmLEC1-A 的 BL21(DE3)菌液活化至 OD600=0.6 后，分別加入 0.0.5mM 的 IPTG，誘導(dǎo) 4.5h，經(jīng) SDS-PAGE 電泳檢測結(jié)果顯示，在 35kDa 左右處出現(xiàn)目的白如圖 3-3，，表明該蛋白已成功表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2694076