【摘要】：菊花是我國十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一,觀賞和經(jīng)濟(jì)價值極高。目前,切花菊在設(shè)施栽培的周年生產(chǎn)中,冬季低溫環(huán)境及土壤鹽漬化問題嚴(yán)重影響了切花菊的生產(chǎn)和品質(zhì)。因此,培育抗低溫耐鹽菊花新品種已成為切花菊育種的一個重要目標(biāo)。本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序和生理指標(biāo)測定的結(jié)果,對切花菊響應(yīng)低溫脅迫機(jī)制進(jìn)行了初步探討,挖掘出潛在的抗低溫優(yōu)良基因,并鑒定了DgWRKY4基因的耐鹽功能,為培育抗低溫耐鹽菊花新品種提供了有效的基因儲備。本研究建立了菊花葉在不同低溫環(huán)境條件下的四個cDNA文庫:(T01)正常溫度條件(25±2℃),作為對照;(T02)4℃,24h;(T03)先4℃處理24h(冷馴化過程),后-4℃處理4h;(T04)-4℃,4h,并對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序(q值0.01,FC(Fold Change)≥2),共得到93837條unigene,其中36462條得到注釋,7583條為差異表達(dá)基因。研究挖掘出大量抗低溫基因,主要涉及與低溫傳感和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜穩(wěn)定性、活性氧清除、滲透調(diào)節(jié)等方面。本研究將經(jīng)過冷馴化處理和未經(jīng)冷馴化處理的菊花幼苗置于相同的凍害條件下處理。生理測定結(jié)果表明,未經(jīng)過冷馴化的菊花(T04)明顯比經(jīng)受過冷馴化階段的菊花(T03)萎蔫地更快;且經(jīng)過冷馴化菊花的抗氧化酶(POD和CAT)活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量均高于未經(jīng)冷馴化的菊花,電導(dǎo)率、H_2O_2和O_2~-的累積量低于未經(jīng)冷馴化的菊花。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明,T03比T04有更多基因的表達(dá)水平上調(diào),且T03菊花中部分響應(yīng)低溫的關(guān)鍵基因的上調(diào)幅度明顯大于T04菊花。研究表明:冷馴化過程有利于菊花抗低溫機(jī)制的建立和耐凍性的提高。本研究鑒定了轉(zhuǎn)DgWRKY4基因菊花對鹽脅迫的耐受性。試驗表明,DgWRKY4能受到NaCl的誘導(dǎo)表達(dá),在正常條件下,野生型菊花不同組織中DgWRKY4的表達(dá)水平為葉莖根。在正常生長條件下,轉(zhuǎn)基因菊花和野生型菊花在生長發(fā)育上沒有明顯差異。而在鹽脅迫下,當(dāng)野生型菊花萎蔫、變黃時,轉(zhuǎn)基因菊花依然長勢良好,其存活率較高。經(jīng)生理測定發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫下,轉(zhuǎn)基因菊花的葉綠素含量、凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)均高于野生型菊花;且轉(zhuǎn)基因菊花較野生型菊花有較低的丙二醛(MDA)、H_2O_2、O_2~-含量,較高的脯氨酸和可溶性糖含量以及較高的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性。運(yùn)用qPCR技術(shù)對DgWRKY4下游抗性相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫下,轉(zhuǎn)基因菊花中編碼ROS清除酶的DgCuZnSOD,DgCAT,DgAPX基因和編碼脯氨酸合成酶的DgP5CS基因的表達(dá)水平均顯著高于野生型菊花,此外DgWRKY4還誘導(dǎo)了其他轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)表達(dá)。以上研究為培育抗低溫耐鹽新品種提供了有效的基因儲備。
【圖文】：

數(shù)據(jù)庫Database注釋基因數(shù)量Annotated gene number百分比PercentageCOG 10226 10.90%GO 19534 20.82%KEGG 12584 13.41%KOG 20400 21.74%Pfam 24137 25.72%Swiss-Prot 23437 24.98%eggNOG 33201 35.38%Nr 35370 37.69%All Annotated 36462 38.86%Total Unigenes 93873

圖 2-2 菊花轉(zhuǎn)錄組的 GO 功能分類Fig. 2-2 GO classification of the annotated genes.基于 KOG 數(shù)據(jù)庫的預(yù)測，本研究將 20400 個基因分為 25 個功能分類。在這些分，，基因注釋到最多的類別為： 一般功能預(yù)測μ、翻譯后修飾，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，伴侶μ、轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制μ、 碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝μ、 次生代謝產(chǎn)物合成，運(yùn)輸和分解μ等。詳OG 分類結(jié)果如圖 2-3.
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S682.11

【相似文獻(xiàn)】

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1 王珂;菊花的抗低溫基因挖掘及DgWRKY4抗鹽性鑒定[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

2 田效琴;菊花DgWRKY5及DgWRKY4基因的克隆和功能鑒定[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

本文編號：2694387