【摘要】：氨基酸轉運蛋白AAPs基因在擬南芥中被首次發(fā)現,經大量實驗結果證明擬南芥中AAPs基因對植株體內氨基酸的種類和數量起到調控作用。越來越多的科學家證明了AAPs基因主動參與一些植物體內營養(yǎng)物質的吸收及代謝產物的轉運。但在玉米中關于AAP基因的研究鮮見報道,因此,本研究旨在從玉米中克隆出AAP基因并探究其功能,從而明確玉米中AAP基因的表達與氨基酸吸收的關系,為玉米吸收氨基酸分子機制的研究提供理論基礎,并為今后創(chuàng)造氨基酸吸收含量高的新玉米材料提供理論依據和候選基因。本研究克隆了玉米ZmAAP基因,并通過本底表達和真核表達對該基因的功能進行了初步分析,主要結果如下:1.采用同源克隆技術得到玉米中一段未知功能基因片段1396bp。運用生物信息學對該基因序列進行分析,采用RT-PCR技術克隆得到該玉米未知功能基因片段1396bp。運用生物信息學對該序列進行分析,可知該未知功能基因編碼區(qū)核苷酸序列與大麥AAP1基因的相似性最高,相似度為87%,初步證明從玉米中克隆的基因可能為AAP基因的核酸序列,命名為ZmAAP。ZmAAP基因全長cDNA序列包括1212bp的開放閱讀框,ZmAAP基因編碼的氨基酸序列氨基酸數403個,相對分子質量42.88KDa,理論等電點9.24,正、負電荷殘基總數分別是18和30,在組成ZmAAP蛋白編碼的20種氨基酸中絲氨酸所占比例最高,達到13.4%,而組氨酸所占比例最低,僅為1.0%,總平均親水性為0.220。ZmAAP蛋白包含信號肽,剪切位點位于38,39殘基處;有5個跨膜區(qū)。2.通過熒光定量PCR測定不同生育期(出苗期、拔節(jié)期、大喇叭口期、抽雄期、吐絲期、乳熟期、完熟期)玉米植株和不同成熟度(10天、20天、30天、40天、50天、60天)玉米種子中ZmAAP基因的組織表達情況。同時測定了不同生育期玉米植株和不同成熟度種子中總游離氨基酸含量、可溶性蛋白含量、20種氨基酸組分這三個生理生化指標,發(fā)現在玉米根、葉、種子中總游離氨基酸含量與ZmAAP基因表達量的變化趨勢相一致。在玉米葉、種子中可溶性蛋白含量與ZmAAP基因表達量的變化趨勢相一致。ZmAAP基因在玉米根、葉、種子中表達量最高的時期相應部位堿性氨基酸含量均增速加快。后經生理生化指標與ZmAAP基因表達量之間的相關性分析表明玉米根、葉、種子中ZmAAP基因的表達量與總游離氨基酸含量呈顯著正相關性,玉米葉和種子中ZmAAP基因的表達量與可溶性蛋白含量呈顯著正相關性,因此初步確定ZmAAP基因的表達能夠影響氨基酸和蛋白質的含量。3.通過構建植物表達載體pCAMBIA3301-ZmAAP后經農桿菌介導的方法將ZmAAP基因導入擬南芥,再經除草劑篩選從而獲得轉ZmAAP基因擬南芥,獲得T2代轉基因擬南芥25株。以T2代轉基因型擬南芥為實驗材料,在擬南芥不同生育期對其進行表型分析,發(fā)現轉基因型擬南芥的根系長度,側根的數量,葉片表面積,分枝莖數量明顯高于野生型擬南芥。4.通過測定轉基因型和野生型擬南芥中總游離氨基酸含量和可溶性蛋白含量,明確轉基因型擬南芥中總游離氨基酸含量和可溶性蛋白質含量明顯高于野生型擬南芥,符合表型分析結果。通過測定不同生育期(出苗期,抽薹期,開花期)轉基因型擬南芥植株ZmAAP基因的組織表達情況,發(fā)現ZmAAP基因在葉片中的表達量最高。將ZmAAP基因的表達量與總游離氨基酸含量和可溶性蛋白質含量進行了相關性分析,結果表明ZmAAP基因表達量的變化與總游離氨基酸含量呈現顯著正相關性。因此,明確ZmAAP基因在擬南芥中的表達能夠提高擬南芥中氨基酸的含量。
【圖文】：

AAP 基因全長 cDNA 的克隆段的擴增：根據 NCBI 中發(fā)布的擬南芥和大麥中 AAP1 基因的氨基設計 1 對簡并引物 A1、A2，以玉米葉片總 RNA 為模板，以 Oligd cDNA，利用簡并引物進行 RT-PCR 反應，擴增出 355bp 的片段（因部分序列測序結果與擬南芥、大麥 AAP 基因比對結果如圖 2-3 所P 基因全長 cDNA 的克�。和ㄟ^中間片段的堿基序列在 NCBI 中 B能的玉米基因片段，以合成的玉米 cDNA 為模板，B1、B2 為引物，經 1%瓊脂糖凝膠電泳，在 1400bp 處出現特異性片段，大小與預測收，連接，轉化，后對其進行質粒雙酶切驗證（圖 2-5）。測序結因測序序列與玉米基因組未知功能基因的相似性達到 99.67%（圖得到玉米 AAP 基因片段 1396bp。M.DL2000Marker1.為總RNAM.DL2000Marker1.TotalRNA圖2-1玉米總RNA的電泳圖1ElectrophoresisoftotalRNAfrommaizeM.DL2000 Marker 1.PCR 產物M.DL2000 Marker 1.PCR produc圖 2-2 玉米AAP基因的部分序列電泳Fig.2-2 Partial sequence electrophoresis results of

2.3.1.2 玉米 AAP 基因全長 cDNA 的克隆中間片段的擴增：根據 NCBI 中發(fā)布的擬南芥和大麥中 AAP1 基因的氨基酸序列，在基因保守區(qū)設計 1 對簡并引物 A1、A2，以玉米葉片總 RNA 為模板，，以 OligdT 為反轉錄引物，合成 cDNA，利用簡并引物進行 RT-PCR 反應，擴增出 355bp 的片段（圖 2-2）。玉米 AAP 基因部分序列測序結果與擬南芥、大麥 AAP 基因比對結果如圖 2-3 所示。玉米 AAP 基因全長 cDNA 的克隆：通過中間片段的堿基序列在 NCBI 中 BLAST 得到一段未知功能的玉米基因片段，以合成的玉米 cDNA 為模板，B1、B2 為引物，在進行 PCR擴增。產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳，在 1400bp 處出現特異性片段，大小與預測值相符（圖2-4）。經回收，連接，轉化，后對其進行質粒雙酶切驗證（圖 2-5）。測序結果顯示玉米全長 AAP 基因測序序列與玉米基因組未知功能基因的相似性達到 99.67%（圖 2-6），表明成功分離得到玉米 AAP 基因片段 1396bp。M.DL2000Marker1.TotalRNA圖2-1玉米總RNA的電泳圖Fig.2-1ElectrophoresisoftotalRNAfrommaizeM.DL2000 Marker 1.PCR products圖 2-2 玉米AAP基因的部分序列電泳結果Fig.2-2 Partial sequence electrophoresis results of maize AAP
【學位授予單位】：吉林農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S513

【參考文獻】

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本文編號：2694011