【摘要】：非洲狗牙根(Cynodon transvaalensis Burtt-Davy)是暖季型草坪草,廣泛應(yīng)用于雜交狗牙根育種。作為固著生物,植物在高溫條件下必須構(gòu)建專門的防御系統(tǒng)來維持自身生長及后代繁衍。作為熱信號傳導(dǎo)鏈的終端組件,熱激轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到其下游熱誘導(dǎo)基因啟動子的熱激元件上,調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄活性,在熱激響應(yīng)中發(fā)揮主要作用,其中熱激轉(zhuǎn)錄因子A2(HsfA2)是植物響應(yīng)高溫過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。本研究從非洲狗牙根中分離出HsfA2基因(CtHsfA2b),在擬南芥中過量表達(dá),研究HsfA2基因介導(dǎo)的耐熱生理功能,并通過下游基因表達(dá)分析研究此熱激轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)耐熱性的分子機(jī)理,為冷季型草坪草耐熱性育種奠定基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下:1從非洲狗牙根中分離出HsfA2基因的cDNA序列,包括1386 bp核苷酸,1095 bp ORF編碼365個(gè)氨基酸。從氨基酸序列同源比對和聚類分析可以看出:CtHsfA2b基因同小米、水稻及二穗短柄草中HsfA2b基因的序列相似度極高,該基因?qū)儆跓峒まD(zhuǎn)錄因子A2b亞組,我們將其命名為非洲狗牙根HsfA2b基因(CtHsfA2b,GenBank登錄號:KU156630)。2構(gòu)建了 CtHsfA2b-eGFP質(zhì)粒并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入擬南芥葉肉原生質(zhì)體,DAPI和GFP的熒光信號完全重疊在細(xì)胞核說明CtHsfA2b定位在細(xì)胞核。CtHsfA2b轉(zhuǎn)基因擬南芥的植物表達(dá)載體pEarleyGate 103中也有一個(gè)GFP編碼區(qū)域,通過觀察轉(zhuǎn)基因植株根尖細(xì)胞,進(jìn)一步驗(yàn)證CtHsfA2b蛋白定位于細(xì)胞核。3非洲狗牙根中葉和根的qRT-PCR分析結(jié)果顯示:CtHsfA2b基因迅速響應(yīng)熱脅迫,在42℃熱處理30min內(nèi)表達(dá)水平持續(xù)上升,到lh時(shí)達(dá)到最高水平。CtHsfA2b基因在葉片中的表達(dá)比在根中更高,響應(yīng)也更早�；虮磉_(dá)達(dá)到最高水平后逐漸下降并在恢復(fù)30℃正常生長溫度后回落到初始水平。4構(gòu)建CtHsfA2b基因表達(dá)載體并將它轉(zhuǎn)入WT和熱敏感擬南芥突變體hsfa2中進(jìn)行過量表達(dá)分析:CtHsfA2b基因及其GFP融合蛋白在35S:CtHsfA2b和35S:CtHsfA2b/hsfa2中均有表達(dá),但在hsfa2突變體及WT中均不表達(dá)。對比WT及hsfa2突變體擬南芥,CthsfA2b基因過表達(dá)擬南芥在高溫脅迫下表現(xiàn)出更高的存活率,凈光合速率、光化學(xué)效率和葉綠素含量提高,電解質(zhì)滲漏率降低,說明CtHsfA2b過量表達(dá)提高了擬南芥幼苗的耐熱性。5檢測熱脅迫后恢復(fù)階段相關(guān)數(shù)據(jù),由于hsfa2突變體從熱脅迫中釋放出來之后一直不能得到恢復(fù),我們認(rèn)為熱處理對hsfa2突變體來說是致死的,但是對WT和35S:CtHsfA2b/hsfa2傷害卻很小,說明CtHsfA2b過量表達(dá)能夠拯救hsfa2突變體的熱敏感缺陷,并使其耐熱性恢復(fù)到野生型的水平。6轉(zhuǎn)CtHsfA2b基因植株還表現(xiàn)出對一系列下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,包括提高編碼抗壞血酸過氧化物酶基因(AtApx2)和熱休克蛋白基因[AtHsp18.1-CI,AtHsp22.0-ER,AtHsp25.3-P and AtHsp26.5-P(r),AtHsp70b and AtHsp101-3]的轉(zhuǎn)錄水平,高溫誘導(dǎo)這些基因表現(xiàn)出典型的熱應(yīng)答特征。7熱脅迫處理1小時(shí)后,活性氧組分O2-和H2O2在WT中的積累高于在轉(zhuǎn)基因植株中的積累,說明轉(zhuǎn)基因株系的抗氧化能力得到增強(qiáng),AtApx2可能起到了重要作用。通過酵母單雜交(Y1H)及熒光素酶(LUC)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明,CtHsfA2b基因可以結(jié)合到位于AtApx2基因啟動子的熱激元件(HSE)上,從而加強(qiáng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性。以上結(jié)果表明,CtHsfA2b基因受熱誘導(dǎo),在高溫脅迫下迅速表達(dá),通過上調(diào)抗氧化及分子伴侶防御機(jī)制,從而發(fā)揮熱保護(hù)作用。CtHsfA2b基因有潛力作為候選基因發(fā)揮作用,為冷季型草坪草耐熱性改良育種奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S688.4

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