發(fā)布時(shí)間：2020-06-01 02:21

【摘要】：鋁(Aluminum,Al)毒是酸性土壤上限制作物生產(chǎn)的最大因素之一。細(xì)胞壁是植物感知鋁毒害的第一屏障,也是累積鋁的重要部位。植物細(xì)胞壁的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)以及多糖構(gòu)成與鋁毒及抗鋁的發(fā)生緊密相關(guān)。尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-Glucosetransferase,UGTA)廣泛存在于植物體中,主要負(fù)責(zé)將糖基從活化的供體分子移動(dòng)到接受體上,直接參與多糖、二糖的生物合成。根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn),鋁脅迫下大豆根系UGTA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào),據(jù)此,本研究旨在研究UGTA是否能夠調(diào)控細(xì)胞壁多糖的結(jié)構(gòu)或組分從而影響鋁毒的發(fā)生。本研究以大豆耐鋁品種吉育70作為實(shí)驗(yàn)材料,利用前期大豆根尖轉(zhuǎn)錄譜中發(fā)現(xiàn)的響應(yīng)于鋁脅迫的UGTA基因信息,從大豆基因組中篩選得到三個(gè)基因(Glyma.13G090300,Glyma.11G000500和Glyma.08G244700),分別命名為Gm UGTA1,Gm UGTA2和Gm UGTA3,利用生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式分析以及超表達(dá)于大豆發(fā)根后的細(xì)胞壁部分糖類分析解析三個(gè)UGTA基因的功能以及與鋁毒的關(guān)系。具體研究結(jié)果如下。1.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Gm UGTA1(Glyma.13G090300),Gm UGTA2(Glyma.11G000500)和Gm UGTA3(Glyma.08G244700)基因都對(duì)鋁有一定的響應(yīng)。在鋁處理的24小時(shí)內(nèi),Gm UGTA1的轉(zhuǎn)錄峰度變化不大,只在4小時(shí)時(shí)有約3倍的提高化。Gm UGTA2和Gm UGTA3的轉(zhuǎn)錄豐度從12小時(shí)提高,前者在24小時(shí)約為18倍,后者則達(dá)到27倍。2.將攜帶UGTA基因的植物表達(dá)載體p EGAD-3XHA-LUC,利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599轉(zhuǎn)化至大豆發(fā)根中。通過LUC標(biāo)簽檢驗(yàn),得到超表達(dá)的發(fā)根。然后通過LC-MS代謝組學(xué)初步分析,發(fā)現(xiàn)木糖、葡萄糖等糖類改變最為顯著。因此對(duì)大豆發(fā)根細(xì)胞壁進(jìn)行提取,對(duì)細(xì)胞壁多糖和木糖、木質(zhì)素、葡萄糖含量等糖類含量測定。結(jié)果表明,無鋁處理?xiàng)l件下,Gm UGTA1-OE和Gm UGTA2-OE的細(xì)胞壁多糖、胼胝質(zhì)、木糖含量改變較顯著,木質(zhì)素含量改變不顯著,葡萄糖含量與野生型相比明顯下降;Gm UGTA3-OE的細(xì)胞壁多糖、胼胝質(zhì)含量改變較顯著,但與WT發(fā)根相比,其木糖、葡萄糖含量有顯著下降,木質(zhì)素含量改變不顯著。有鋁處理?xiàng)l件下,Gm UGTA1-OE和Gm UGTA3-OE的細(xì)胞壁多糖、胼胝質(zhì)含量進(jìn)一步提高,木糖、木質(zhì)素含量改變不大,葡萄糖含量與野生型相比明顯下降;Gm UGTA2-OE的細(xì)胞壁多糖、胼胝質(zhì)、木糖、木質(zhì)素含量改變不大,葡萄糖含量與野生型相比明顯下降。
【圖文】：

通過提高了轉(zhuǎn)基因植物的抗性來盡可能降低影響。由此可見，UGT解除植物內(nèi)外源毒素同樣發(fā)揮了重要作用。近些年來，對(duì)于植物細(xì)胞壁中糖基轉(zhuǎn)移酶的研究越來越多、越來越全面。物中一些核苷酸底物合成的途徑已經(jīng)被證實(shí)，圖 1.1 所示是植物細(xì)胞壁部糖的核苷酸底物的合成模式圖。由圖所示，葡萄糖-1-P（Glc-1-P）在 UDP糖焦磷酸化酶（UDP-Glu-pyrophosphorylase）的催化下能夠合成 UDP-葡萄UDP-D-Glc），而 UDP-D-葡萄糖（UDP-D-Glc）隨后能在 UDP-葡萄糖-4-異（UDP-Glc-4-epimerase）的作用下形成 UDP-D-半乳糖（UDP-D-Gal），而的代謝可以導(dǎo)致花粉管中 UDP-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA），UDP-木糖DP-Xyl）和 UDP-阿拉伯糖（UDP-Ara）的生成（Bacic 等，1994），這些最終能夠形成一張種類豐富、相互關(guān)聯(lián)的多糖網(wǎng)絡(luò)（Wakabayashi 等，9）；

圖 2.1 植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301 結(jié)構(gòu)圖Fig. 2.1 The structure of plant expression vector pCAMBI33012.2.5.5 載體與目的基因的連接將已經(jīng)先行化的載體和回收得到的目的基因用 Infusion 酶進(jìn)行連接，連接體系如下：體系 體積5x InFusion HD Enzyme Premix目的基因線性化載體0.5μl1μl1μl離心混勻后，，金屬浴 50℃連接 3h，接下來可轉(zhuǎn)化大腸桿菌。2.2.5.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌實(shí)驗(yàn)中使用的大腸桿菌感受態(tài) DH5α，采用熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化步驟中涉
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S565.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2690822