【摘要】：目的:白細胞介素-17家族(IL-17s)成員是一類促炎細胞因子,主要由輔助性T細胞T_H17分泌,在宿主防御以及各種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。草魚是一種鯉科草食性魚類,是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種,但其易受病原菌侵襲,產生炎癥甚至死亡。腸道是重要的粘膜免疫組織,因常與腔內致病因子接觸,腸粘膜易受感染。本研究旨在克隆草魚IL-17家族基因,分析其基因結構,檢測其在生理及病理條件下各組織中的表達水平,并對其在腸道炎癥中的作用進行初步鑒定。方法:運用快速擴增cDNA末端技術及常規(guī)PCR技術從草魚中克隆IL-17家族基因的蛋白編碼區(qū)序列。運用生物信息學方法分析基因的結構、編碼的氨基酸序列、分子演化特征。運用實時熒光定量PCR(qPCR)技術檢測健康草魚及嗜水氣單胞菌刺激下各組織中IL-17家族基因的表達水平。通過肛灌及腹腔注射嗜水氣單胞菌的方法建立草魚腸道炎癥模型,觀察細菌感染后腸道的病理變化,檢測腸道中IL-17家族基因在感染后第1、3和7天時的相對表達量。結果:我們鑒定了草魚的IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-17C、IL-17N基因。草魚IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-17C和IL-17N的蛋白編碼區(qū)序列長分別為420、474、489和411 bp,分別編碼139、157、162和136個氨基酸,均包括3個外顯子,2個內含子�；诎被嵝蛄袠嫿ǖ南到y(tǒng)進化樹顯示,草魚IL-17家族基因(IL-17A/F1、IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-17C、IL-17D、IL-17N)與其他脊椎動物相對應的IL-17基因為一支,且與斑馬魚、鯉魚一致性較高。qPCR分析結果顯示,IL-17家族在各個組織中都有表達,但組織間的表達量存在較大差異。IL-17A/F1、IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-17D在血液中表達量最高,IL-17C在心臟中表達量最高,而IL-17N則在肌肉、皮膚、腦中表達量較高;所有基因在脾臟、頭腎、體腎中表達量較低。腹腔注射嗜水氣單胞菌24 h后,IL-17家族基因在不同組織中的表達量發(fā)生了變化,其中在腸道組織中均顯著上調。采用腹腔注射和肛灌嗜水氣單胞菌的方式均可使草魚出現炎癥反應。其中,腹腔注射嗜水氣單胞菌可導致包括腸道在內的全身性炎癥并產生腹水,而肛灌嗜水氣單胞菌主要引起腸道的炎癥。腸道病理切片顯示,腹腔感染后第3天腸道炎癥最為嚴重,腸絨毛出現缺損現象;感染后第7天腸道粘膜層炎性細胞明顯減少。與腹腔感染相比,肛灌感染引起的腸道炎癥相對較弱,但腸道炎癥癥狀最明顯的時間也出現在肛灌感染的第3天。qPCR結果顯示,腹腔注射感染后,IL-17A/F2、IL-17C持續(xù)上調表達,IL-17D在7天內始終高表達,而IL-17A/F1、IL-17A/F3與IL-17N則表現為第1、7天顯著上調,第3天上調幅度較小甚至下調。肛灌嗜水氣單胞菌后的第1天,除IL-17D外,其余5個基因上調顯著;第3天的表達趨勢不同,其中IL-17A/F1、IL-17A/F3、IL-17C上調達顯著水平,IL-17A/F2、IL-17D、IL-17N表達量基本回復到正常水平;第7天時,IL-17家族六個基因均上調。結論:克隆并鑒定了草魚IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-17C、IL-17N基因。腹腔注射與肛灌嗜水氣單胞菌后引起的腸道炎癥中,草魚IL-17(IL-17A/F1、IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-17C、IL-17D和IL-17N)均產生了免疫應答,起到重要的調節(jié)作用,但各種基因調節(jié)方式有所差異。其中,IL-17N在嗜水氣單胞菌感染24 h后上調幅度最大,在草魚腸道炎癥發(fā)生前期發(fā)揮明顯的促炎作用,IL-17N基因可用于炎癥早期診斷。
【圖文】：

1.3 無脊椎動物 IL-17 基因無脊椎動物也有IL-17基因的存在，目前已從太平洋牡蠣(Crassostreaas)[35,40]、三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）[36]、合浦珠母貝（Pinctada fucata）[3海鞘（Ciona intestinalis）[38]中發(fā)現了IL-17基因。2 IL-17 受體2.1 哺乳動物 IL-17 受體1995年，Yao發(fā)現了IL-17A的受體IL-17RA，這是第一個被發(fā)現的IL-17受體[22,41現的IL-17受體家族成員有五個（如圖1），分別是IL-17RA、IL-17RB、IL-17R17RD、IL-17RE，所有的家族成員都位于22號染色體，并且都是一型單次跨膜蛋保守結構基序，包括一個胞外的類纖維結合素結構域和一個胞內的SEF/IL-17R2-43]。IL-17受體家族成員之間可以同源二聚體或異源二聚體的形式組合為不同的物，IL-17RA作為這個家族里最大的分子，是至少四個配體傳遞信號的通用亞

圖 2 IL-17A 與 IL-17F 的來源及其作用機制[30]2000年，，IL-17A的同源基因IL-17C被克隆出來。目前，關于IL-17C在小鼠腸膜免疫反應中的作用較為明確[45]。當用IL-17C處理體外培養(yǎng)的小鼠原代野生型道上皮細胞時，IL-17C可與其受體IL-17RE結合，激活NF-κB和MAPK信號通路下游傳遞信號[48]。在小鼠遭遇鼠檸檬酸桿菌（Citrobacter rodentium）感染時，道細胞中IL-17C上調，進一步研究發(fā)現，Flagellin、LPS等入侵宿主的病原菌AMP分子可以使腸道上皮細胞產生IL-17C，此外TNFα和IL-1β等病原菌激活的因子也可使上皮細胞產生IL-17C。在感染早期，宿主IL-17C與IL-22會上調，IL-17C和IL-22兩種細胞因子處理體外培養(yǎng)的腸道上皮細胞時，細胞內的100A8、S100A9及Reg3γ等抗菌基因上調百倍。這表明，IL-17C和IL-22在宿主早期共同發(fā)揮抗菌作用[49]。Fort等基于IL-17A序列，從人和鼠的基因組中鑒定了IL-17A的同源基因IL-即IL-17E）[50]。肺和腸道上皮細胞、Th2細胞、腦內皮細胞、肺部的嗜酸性粒
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S943

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本文編號：2691330