【摘要】：低等白蟻散白蟻屬Reticulitermes的工蟻(worker)品級具有發(fā)育的可塑性,既可以終生維持為工蟻品級,也可以根據(jù)巢群需求分化成巢群的守衛(wèi)者兵蟻,或者分化成為巢群的補充繁殖蟻。在圓唇散白蟻R.labralis(Hisa)中,當(dāng)巢群發(fā)生隔離或者繁殖蟻缺失時,雌性老齡工蟻會經(jīng)過兩次蛻皮,歷經(jīng)前補充繁殖蟻(pre-neotenic reproductive,pre-NR)階段發(fā)育成補充繁殖蟻(neotenic reproductives,NR),接替巢群的繁殖工作。目前關(guān)于雌性工蟻向補充繁殖蟻品級的分化調(diào)控機理以及功能性基因研究甚少。在本研究中,以圓唇散白蟻原始巢群的雌性老齡工蟻、隔離飼養(yǎng)三周的雌性老齡工蟻(isolated worker,IW)以及由隔離工蟻分化而來的雌性補充繁殖蟻為研究對象,使用RNA-Seq篩選出雌性工蟻向補充繁殖蟻轉(zhuǎn)化調(diào)控的關(guān)鍵候選基因及其相關(guān)的代謝調(diào)控通路,揭示雌性工蟻向補充繁殖蟻轉(zhuǎn)化過程中的基因調(diào)控。主要研究結(jié)果如下:1.Worker、IW和NR通過轉(zhuǎn)錄組測序共獲得66.85Gb的Clean reads,每個樣品的Q30均高于90.96%且GC含量在43.33%-44.91%之間,組裝拼接后共獲得112,954個unigenes,通過與數(shù)據(jù)庫比對,其中有17,535個unigenes在四大數(shù)據(jù)庫中均被注釋,Nr注釋unigene為40,073個,在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中比對得到29,540個unigenes,在KOG分類中,共獲得有25,453個KOG功能注釋,KEGG中共注釋得到的unigene為20,116個。此次轉(zhuǎn)錄組測序首次完成了圓唇散白蟻worker、IW和NR數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建,為散白蟻基因的功能研究、白蟻生長發(fā)育和品級分化等提供了豐富的基因數(shù)據(jù)庫資源,并對揭示工蟻繁殖可塑性的機理提供了分子研究依據(jù)。2.使用edger軟件對樣本間的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選,結(jié)果表明,worker與IW的差異表達(dá)基因為17,405個,IW與NR的差異表達(dá)基因為30,332個,worker與NR的差異表達(dá)基因為7,016個,此次分析結(jié)果為后期基因功能研究提供豐富的資源,也為工蟻轉(zhuǎn)化過程中關(guān)鍵調(diào)控基因的篩選提供了參考數(shù)據(jù)。接下來使用STEM軟件對worker、IW和NR的差異表達(dá)基因進(jìn)行趨勢聚類分析,結(jié)果表明,有38,070個差異表達(dá)基因聚類為8個表達(dá)模式,通過對差異表達(dá)基因聚類分析獲得符合工蟻轉(zhuǎn)化調(diào)控的顯著趨勢模塊profile5,結(jié)合GO以及KEGG富集分析,篩選出Ras信號通路的Ras基因和Ca M基因以及白蟻特有的免疫基因Termicin和Transferrin作為關(guān)鍵的候選基因,通過對候選基因表達(dá)量的研究揭示工蟻轉(zhuǎn)化為補充繁殖蟻的基因調(diào)控機理。3.使用q RT-PCR對worker、IW和NR的測序結(jié)果進(jìn)行檢測,篩選出5個Ras信號通路基因和7個免疫相關(guān)基因進(jìn)行q RT-PCR分析,檢測結(jié)果在雌性工蟻向補充繁殖蟻轉(zhuǎn)化過程中基因的表達(dá)變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果相符,表明本次測序獲得的數(shù)據(jù)和分析結(jié)果真實可靠,可以用于后期生物學(xué)分析比較。4.Ras蛋白作為Ras基因的表達(dá)產(chǎn)物,在胞外信號刺激所產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中處于重要位置。隔離工蟻通過外界環(huán)境隔離因子的刺激,使Ras基因的表達(dá)量顯著升高,Ras基因在IW中的表達(dá)量約是worker的130倍(p0.05),NR的20倍(p0.05),并且測序結(jié)果顯示Ras富集于profile5中的36條代謝通路,說明Ras基因在工蟻轉(zhuǎn)化過程中對于傳遞細(xì)胞產(chǎn)生的生長分化信號起到重要的開關(guān)調(diào)控作用。根據(jù)Ras在果蠅和家蠶中的功能研究推測Ras在工蟻轉(zhuǎn)化過程中的高表達(dá)可能促進(jìn)蛻皮激素的分泌以及工蟻的生長。鈣調(diào)蛋白(calmodulin,Ca M)可以啟動DNA的合成并且促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂后期。工蟻在隔離飼養(yǎng)的過程中解除了性信息素對其抑制,通過q RT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)工蟻隔離一周(IW1)以后Ca M基因的表達(dá)量明顯上調(diào),隔離三周(IW)時達(dá)到最高,此時的表達(dá)量約是worker的333倍(p0.05),NR的47倍(p0.05),表明Ca M在工蟻的轉(zhuǎn)化過程中促進(jìn)細(xì)胞的生長。5.Termicin和Transferrin是白蟻特有的免疫基因,在NR中的表達(dá)量顯著高于worker和IW,表明在圓唇散白蟻中的NR對于病原菌具有很強的抵抗力。實時定量結(jié)果驗證的免疫相關(guān)基因在IW的表達(dá)量明顯高于worker,表明在工蟻轉(zhuǎn)化為補充繁殖蟻的過程中對于病原菌的抵抗能力增強。6.首次研究促性腺激素釋放激素受體(gonadotrophin releasing hormone receptor,Gn RHR)基因在雌性工蟻向補充繁殖蟻轉(zhuǎn)化中的表達(dá)動態(tài)變化,以工蟻為對照組對q RT-PCR實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果表明,在NR中的表達(dá)量顯著高于worker和Pre-NR,約是worker的12倍(p0.05),Pre-NR的5倍(p0.05),說明Gn RHR在雌性工蟻轉(zhuǎn)化過程中對性腺發(fā)育以及卵母細(xì)胞成熟具有重要的調(diào)節(jié)作用。通過本次轉(zhuǎn)錄組測序為工蟻向補充繁殖蟻的分化研究建立了豐富的基因數(shù)據(jù)庫,本次對于雌性工蟻向補充繁殖蟻轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的研究,不僅揭示了工蟻向補充繁殖轉(zhuǎn)化中基因之間的調(diào)控機理,也為后期建立靶標(biāo)基因RNAi體系以及鑒定新基因的功能奠定了基礎(chǔ)。此外,為研發(fā)白蟻防治的新型藥物提供分子生物學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

保幼激素的分泌比其他品級多[11, 12]。繁殖蟻的性腺發(fā)育已經(jīng)成熟，在巢群責(zé)交配以及產(chǎn)卵。繁殖品級在巢群中的地位至關(guān)重要，，失去繁殖品級的巢群有巢群的滅亡，繁殖品級在保持舊巢群和創(chuàng)建新巢群中有重要的意義。根據(jù)繁殖和來源將其分為原始繁殖蟻和補充繁殖蟻（次級繁殖蟻）。2.1 原始繁殖蟻原始繁殖蟻是指最初建立巢群的蟻王與蟻后。在每年婚飛階段由末齡若蟻轉(zhuǎn)化翅成蟲會飛出原來的巢群，與另一位異性有翅成蟲配對組建新的巢群，在建巢其他白蟻的輔助，只有脫翅的蟻王和蟻后，此時它們需要自行取食并且參與巢以及覓食等活動，當(dāng)巢群中工蟻數(shù)量增多時，蟻王和蟻后會專司繁殖后代，由來完成巢群的建巢以及撫育等工作。原始繁殖蟻在形態(tài)上保持成蟲的特性（圖 1為黑色并且色素沉淀較深、角質(zhì)化程度較高，對于外界環(huán)境適應(yīng)能力較強。原體型比其他品級要龐大，主要負(fù)責(zé)新巢群的繁衍生息。

為巢群的發(fā)展起到至關(guān)重要的作用，無翅型繁殖蟻為巢群的發(fā)展以及擴建提供了有利的條件。1.2 白蟻的品級分化1.2.1 白蟻品級發(fā)育路徑白蟻發(fā)育中通過蛻皮來完成品級間的轉(zhuǎn)化，研究發(fā)現(xiàn)白蟻的蛻皮方式主要有以下三種方式：靜止性蛻皮、漸進(jìn)性蛻皮以及倒退性蛻皮。但是在白蟻的發(fā)育路徑中有些白蟻不一定都經(jīng)歷這三種方式[2]。白蟻作為具有高度組織的社會性昆蟲，其白蟻品級的可塑性和多樣性是它的顯著特征。在高等白蟻中不同品級之間的形態(tài)和功能截然不同，其發(fā)育模式較為穩(wěn)定[27]，而在低等白蟻中為了確保巢群穩(wěn)定和繁衍，各個品級之間可以進(jìn)行靈活的轉(zhuǎn)化[28]。如下以散白蟻屬為例來闡述白蟻的品級分化路徑，在鼻白蟻科的散白蟻屬中，其分化路線主要以若蟻路線和無翅路線早期分支為特征，具體如圖 2。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q963

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2689448