【摘要】：干旱、高溫、冷害、營養(yǎng)匱乏、鹽害以及重金屬毒害等非生物脅迫嚴重影響了植物的生長、發(fā)育和繁衍繼代。植物為了在逆境脅迫下求得生存,通過改變自身的生理生化過程來適應(yīng)脅迫環(huán)境,進化了一套感知和傳遞脅迫信號、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和脅迫響應(yīng)的生理途徑,使植物做出適應(yīng)性反應(yīng)。其中感知和傳遞脅迫信號對于植物適應(yīng)脅迫環(huán)境起著關(guān)鍵的作用,脅迫信號感受器、受體激酶、第二信使、Ca~(2+)信號途徑、脫落酸(ABA)信號途徑、鹽過敏感(Salt overly sensitive,SOS)信號途徑、促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)級聯(lián)途徑、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)信號途徑和轉(zhuǎn)錄因子等都在這個過程中扮演了重要的角色。異三聚體G蛋白(G蛋白)是一種第二信使,其參與的信號轉(zhuǎn)導途徑是真核生物中一種非常保守的跨膜信號轉(zhuǎn)導機制,調(diào)控了信號感知、信號轉(zhuǎn)導、激素響應(yīng)和免疫反應(yīng)等信號途徑。在植物中,G蛋白調(diào)控了植物的形態(tài)發(fā)育、氣孔關(guān)閉、光信號響應(yīng)、糖信號響應(yīng)、生物與非生物脅迫響應(yīng)等生理過程。到目前為止,雖然植物G蛋白信號響應(yīng)非生物脅迫分子機制在擬南芥和水稻等模式植物中的研究報道較多,但其在木本植物中的研究報道很少,且其信號途徑中仍有一些研究不清楚和存在爭議的關(guān)鍵途徑和調(diào)控模式有待闡明。桑樹是一種多年生木本經(jīng)濟植物,其葉片是飼養(yǎng)家蠶最理想的飼料。此外,桑樹在生態(tài)、食用和藥用中也有廣泛的應(yīng)用。桑樹在干旱、鹽脅迫、水澇和重金屬脅迫等逆境脅迫環(huán)境下都有良好的適應(yīng)能力,被認為是一種很有前景的治理生態(tài)脆弱環(huán)境的生態(tài)經(jīng)濟樹種,但對其分子機理的研究還比較少。桑樹G蛋白信號基因的相關(guān)研究也未見報道且通過對桑樹鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)發(fā)現(xiàn)其與大量其他脅迫響應(yīng)基因的連通性較高。因此,開展桑樹G蛋白信號基因的功能研究,不但對于探究桑樹響應(yīng)非生物脅迫機制具有重要的意義,而且也將有助于植物G蛋白信號途徑的不斷完善,特別是仍有待闡明和存在爭議的一些關(guān)鍵途徑。本研究選取新疆和田地區(qū)的桑樹品系策沙6號和策沙12號作為研究材料,對其進行了鹽脅迫處理,轉(zhuǎn)錄組測序分析了桑樹響應(yīng)鹽脅迫的重要基因和桑樹G蛋白信號基因與其他脅迫響應(yīng)基因的連通性。利用生物信息學方法、基因克隆和酵母雙雜交(Y2H)技術(shù)鑒定了桑樹G蛋白信號基因,采用實時定量PCR技術(shù)檢測其在不同組織中以及在G蛋白效應(yīng)物、非生物脅迫和信號分子的處理下的表達情況。在煙草或擬南芥中過表達桑樹G蛋白信號基因,分析了過表達植物對干旱和鹽脅迫抵抗能力的變化。此外,還利用Y2H、酵母三雜交(Y3H)和雙分子熒光互補(BiFC)等技術(shù)篩選分析與G蛋白信號蛋白相互作用的蛋白。論文獲得的主要研究結(jié)果如下:1、桑樹鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組學分析對策沙6號和策沙12號進行鹽脅迫處理后,利用RNA-seq技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組學分析。一共從24個處理樣本中獲得了101589個基因,其中34.72%的基因能夠在NCBI、KEGG、SwissProt和Pfam等公共數(shù)據(jù)庫中獲得注釋。對響應(yīng)鹽脅迫的差異基因進行分析,發(fā)現(xiàn)參與離子轉(zhuǎn)運、ROS清除、ABA生物合成、Ca~(2+)信號途徑和MAPK途徑的基因都不同程度地響應(yīng)鹽脅迫,編碼受體激酶、轉(zhuǎn)錄因子、熱激蛋白、水通道蛋白、胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白、滲透蛋白和△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶的基因也響應(yīng)了鹽脅迫。分析結(jié)果也表明在桑樹種子萌發(fā)階段進行鹽處理,萌發(fā)快的種子長成的植株表現(xiàn)出更強的抗鹽性,通過在種子萌發(fā)階段進行鹽脅迫處理可以篩選出抗性較強的株系,其原因可能是在種子萌發(fā)期進行脅迫后提高了植物面對再次脅迫的抵抗能力,即前處理賦予了植株的脅迫記憶。分析發(fā)現(xiàn)低抗品系中的差異基因顯著多于高低抗品系,暗示低抗品系比高抗品系對鹽脅迫的響應(yīng)更加敏感。對不處理情況下高低抗品系之間的差異基因進行分析發(fā)現(xiàn),在根中的差異基因數(shù)量顯著高于莖和葉中的差異基因,表明高抗和低抗品系間的差異主要在根中體現(xiàn)。對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行WGCNA分析發(fā)現(xiàn),cyan、darkgrey和violet等重要模塊的基因主要富集在剪接體、RNA轉(zhuǎn)運、真核生物核糖體的生物發(fā)生、泛素介導的蛋白水解、基本轉(zhuǎn)錄因子、mRNA監(jiān)控通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工和內(nèi)吞途徑等途徑中。以上結(jié)果暗示在種子萌發(fā)期間進行鹽脅迫處理,可能改變了植物的抗逆性,并賦予了植物在RNA和蛋白質(zhì)水平的脅迫記憶,提高了植物面對再次發(fā)生的鹽脅迫的抵抗能力。對G蛋白信號基因的表達模式進行分析發(fā)現(xiàn),Gα和Gγ2位于brown模塊,Gβ和RGS位于black模塊,Gγ1和RACK1位于green模塊,與G蛋白信號基因連通性較高的基因包括了編碼RLKs、WRKY、E3連接酶、CDPK、細胞色素P450、PPR、ERF和鈣調(diào)蛋白等不同類型蛋白的基因,這些基因參與了植物對脅迫的響應(yīng)。在RACK1共表達基因中,有41個編碼核糖體蛋白的基因,暗示RACK1可能通過調(diào)控核糖體的活性來行駛功能。推測G蛋白信號可能是調(diào)控桑樹脅迫響應(yīng)的重要途徑之一。2、桑樹G蛋白信號響應(yīng)非生物脅迫的分子機理研究通過生物信息學方法和基因克隆技術(shù)從桑樹中獲得了6個G蛋白信號基因,包括1個Gα、1個Gβ、2個Gγ、1個RGS和1個RACK1�；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)桑樹G蛋白信號基因與擬南芥、蕪菁和大豆中對應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)相似,桑樹Gα、Gβ、Gγ1、Gγ2、RGS和RACK1的蛋白質(zhì)序列與陸地植物中對應(yīng)蛋白序列的相似度很高,最高可達90%。Y2H實驗證實MaGα可與MaGβ和MaRGS發(fā)生相互作用,MaGβ可與MaGγ1和MaGγ2發(fā)生相互作用。對桑樹G蛋白信號基因的表達模式進行了分析,結(jié)果顯示G蛋白信號基因在各個組織中表達,并表現(xiàn)出不同的表達模式,其表達還顯著響應(yīng)不同的非生物脅迫和信號分子的處理。此外,本研究也首次使用G蛋白效應(yīng)物處理植物來探究其對G蛋白信號基因表達的影響,G蛋白信號基因的表達受到了霍亂毒素、百日咳毒素、GTPγS、GDPβS和蘇拉明等處理的影響。在煙草中過表達桑樹G蛋白信號,分析其對轉(zhuǎn)基因植株抗性的影響。結(jié)果顯示過表達MaGα和MaRGS降低了植株的抗鹽抗旱性,過表達MaGβ、MaGγ1和MaGγ2提高了植株的抗鹽抗旱性。測定脅迫條件下的生理指標發(fā)現(xiàn),過表達MaGα和MaRGS降低了植株的ROS清除能力,過表達MaGβ、MaGγ1和MaGγ2提高了植株的ROS清除能力。以上工作全面地解析了G蛋白信號途徑基因?qū)Ω珊岛望}脅迫響應(yīng)的調(diào)控模式并闡明了其在擬南芥等植物中的研究結(jié)果存在爭議的調(diào)控模式。分析還發(fā)現(xiàn)NaCl和PEG處理桑樹和煙草后,其可溶性糖含量顯著提高。桑樹和煙草的WNK和ATG基因的表達量不同程度受到NaCl、甘露醇和葡萄糖處理的調(diào)控,這些基因在野生型和轉(zhuǎn)基因煙草中對葡萄糖的敏感性有所不同,在MaGα過表達轉(zhuǎn)基因煙草中對葡萄糖的敏感性有所降低,在其它過表達轉(zhuǎn)基因材料中的敏感性有所增強,表明葡萄糖和細胞自噬可能參與了G蛋白信號介導的植物非生物脅迫響應(yīng)。通過以上工作和結(jié)合前人研究,解決了植物G蛋白響應(yīng)干旱和鹽脅迫研究的一些爭議問題,并推測了一個新的G蛋白響應(yīng)脅迫的分子途徑,即當植物遭遇干旱和鹽脅迫后,葡萄糖含量增加,誘導內(nèi)吞途徑蛋白ATG的積累,同時招募WNK,導致RGS發(fā)生內(nèi)吞,解除其對α亞基的GTP水解活性的促進作用,G蛋白三聚體解離加速,更多的βγ二聚體被解離出來,激活下游脅迫響應(yīng)蛋白,提高植物ROS清除能力,從而引起植物對干旱和鹽脅迫的響應(yīng)。該途徑還有待進一步闡明。3、桑樹RACK1響應(yīng)非生物脅迫的分子機理研究在擬南芥中過表達MaRACK1降低了轉(zhuǎn)基因幼苗的抗鹽抗旱性,降低了轉(zhuǎn)基因種子在脅迫下的萌發(fā)率,并影響了根的發(fā)育,脅迫條件下的轉(zhuǎn)基因擬南芥中的丙二醛(MDA)含量顯著高于野生型植株,脯氨酸含量顯著低于野生型植株。以上結(jié)果表明,MaRACK1是植物干旱和鹽脅迫響應(yīng)的負調(diào)控因子。通過Y2H、Y3H和BiFC等技術(shù)證實桑樹和擬南芥中的RACK1都無法與其對應(yīng)的G蛋白和RGS相互作用,證實了植物的RACK1可能不依賴于G蛋白而調(diào)控植物響應(yīng)干旱和鹽脅迫。此外,我們的實驗也證實MaRACK1無法與MAPK途徑的蛋白發(fā)生相互作用,而MaMAPK3、MaMAPK5、MaMKKK1和MaMKKKA與G蛋白βγ二聚體能夠直接發(fā)生相互作用,證明G蛋白可以直接與MAPK途徑蛋白相互作用,并不需要RACK1的支架蛋白作用,表明RACK1并不是G蛋白信號途徑的成員。以上工作與Cheng等~([91])提出的RACK1介導G蛋白和MAPK級聯(lián)的連接實現(xiàn)脅迫信號傳遞的路徑有些出入,還完善了植物G蛋白信號傳遞到MAPK級聯(lián)信號途徑的關(guān)鍵途徑�；趀Plant(http://bar.utoronto.ca/eplant/)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù),分析了擬南芥中的基因表達情況。結(jié)果顯示,AtRACK1A、AtRACK1B和AtRACK1C基因的表達量受到了干旱和鹽脅迫不同程度地抑制,促進RACK1降解的AtWNK8的編碼基因表達量在干旱和鹽脅迫處理3 h后受到了抑制,負責維持RACK1穩(wěn)定性的AtSUMO1蛋白的編碼基因表達量受到干旱和鹽脅迫顯著的抑制。表明非生物脅迫可能導致了RACK1在轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)表達和蛋白水平的降解,從而使得植物作出適應(yīng)性表現(xiàn)。通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)ERF、NAC、WAKY、bHLH等轉(zhuǎn)錄因子的基因表達受到了MaRACK1過表達的影響,它們也可能受到了RACK1的反饋調(diào)節(jié),參與了脅迫條件下RACK1在轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)表達。通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)RACK1可能通過影響Peroxidase、LEA、Cytochrome P450、glutathione S-transferase和HSF等脅迫響應(yīng)蛋白的積累來調(diào)控植物非生物脅迫響應(yīng)。在這些被MaRACK1調(diào)控的基因中,ERF家族的RAP2-6(AT1G43160)已被證明能夠與擬南芥AtRACK1B直接發(fā)生相互作用且其與CE1和GCC順式元件的結(jié)合能力受到了AtRACK1B的影響,AtLTP4(AT5G59310)、AtLTP(AT2G10940)和GLP3(AT5G20630)等3個基因的編碼蛋白也能夠與RACK1相互作用,它們在植物非生脅迫響應(yīng)中的功能還有待驗證。發(fā)現(xiàn)參與茉莉酸合成和信號途徑的部分基因表達量受到了MaRACK1的調(diào)控,在桑樹中篩選到了一個MaTIFY 10A(又名MaJAZ1)與MaRACK1相互作用,推測RACK1可能通過茉莉酸途徑影響植物的抗逆性。在桑樹分析發(fā)現(xiàn)了一個捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白(MaCP24)和一個果糖-二磷酸醛縮酶(MaFBA)可與MaRACK1發(fā)生相互作用,它們的編碼基因的表達都對脅迫比較敏感,在擬南芥中的同源蛋白AtCAB1(AT1G29930)、AtCAB3(AT1G29910)和AtFBA3(AT2G01140)也被發(fā)現(xiàn)可與擬南芥RACK1相互作用,表明這些蛋白可能在植物脅迫響應(yīng)有一定的作用。以上結(jié)果都表明RACK1不能介導G蛋白和MAPK級聯(lián)信號途徑的連接,并根據(jù)這些結(jié)果提出了非生物脅迫誘導RACK1在轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)表達和蛋白水平的降解可能實現(xiàn)植物適應(yīng)脅迫的新途徑。在正常情況下,RACK1通過影響脅迫響應(yīng)蛋白的表達、茉莉酸信號傳遞和光合作用等過程負調(diào)控干旱和鹽脅迫響應(yīng)。在干旱和鹽脅迫下,ERF、NAC、WAKY和bHLH等轉(zhuǎn)錄因子可能參與誘導RACK1的基因表達量降低,AtWNK8和AtSUMO1等蛋白積累的變化誘導了RACK1蛋白的降解,從而解除RACK1對植物脅迫適應(yīng)性的影響。該途徑還需要更多的工作進一步闡明。
【圖文】：

發(fā)育狀況[66-67]。擬南芥 RGS 突變體 rgs1 的葉片大小和胚軸長度均比野生型高，RGS1 過表株系相比野生型植株表現(xiàn)出更短的胚軸、更小的蓮座葉和花期的延長[48]。圖 1-1 異三聚體 G 蛋白的信號傳遞模型[47]Fig. 1-1 The working model of heterotrimeric G protein

第一章 文獻綜述組織變大，但會降低株高、穗長和粒重，此外，過表達 RGG1 和 RGG2 會改[66-67]。擬南芥 RGS 突變體 rgs1 的葉片大小和胚軸長度均比野生型高，RGS野生型植株表現(xiàn)出更短的胚軸、更小的蓮座葉和花期的延長[48]。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S888.2
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本文編號：2688949