【摘要】：目的:檢測(cè)PPPDE1基因在正常胎鼠及肛門直腸畸形(anorectal malformations,ARMs)胎鼠在肛門直腸發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式,分析該基因在大鼠肛門直腸畸形發(fā)育中可能的調(diào)控作用。方法:健康Wistar大鼠,雌性和雄性大鼠午夜合籠,清晨涂片,確認(rèn)懷孕的大鼠分籠放置。將已妊娠的大鼠分為2組,分別為正常組和乙烯硫脲(Ethylenethiourea,ETU)畸形組�；谓M36只孕鼠于妊娠第10天(Embryonic day10,E10)致畸處理,按125 mg/Kg給予大鼠1%ETU(濃度為1%,以生理鹽水做溶劑)進(jìn)行灌胃,正常組30只孕鼠給予相同劑量12.5 ml/kg的生理鹽水進(jìn)行灌胃。在胎鼠發(fā)育第13(E13)天至16(E16)天時(shí)剖宮取出胚胎。將取出的約1/3胚胎進(jìn)行4%多聚甲醛固定,固定12-24小時(shí),進(jìn)行常規(guī)脫水處理,行石蠟包埋,行3.5μm正中矢狀面連續(xù)切片,后應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行PPPDE1抗體染色。將約2/3胎鼠在低溫條件下行顯微下取材,取出胎鼠泄殖腔直腸組織置于EP管中,并于-80℃冰箱冷凍保存,分別進(jìn)行Western Blot及qRT-PCR定量實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析:數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,差異比較采用IBM SPSS Statistics21統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),以P值表示統(tǒng)計(jì)差異,p0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果,在正常組胎鼠中,E13,PPPDE1陽(yáng)性細(xì)胞稀疏分散在尿直腸膈和后腸上皮;E14,在尿直腸膈、后腸和泄殖腔膜上檢測(cè)到PPPDE1細(xì)胞;E15,尿直腸膈的融合部分以及稀薄的肛膜處可見PPPDE1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá);E16,PPPDE1陽(yáng)性細(xì)胞分布在肛門周圍上皮。在ETU畸形組胎鼠中,E13,PPPDE1陽(yáng)性細(xì)胞于尿直腸膈和后腸上皮廣泛表達(dá);E14,PPPDE1陽(yáng)性細(xì)胞在尿直腸膈及后腸表達(dá)明顯增加;E15,PPPDE1陽(yáng)性細(xì)胞分布于瘺管和后腸上皮;E16,瘺管和直腸上皮有PPPDE1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。2、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果,PPPDE1蛋白表達(dá)在后腸發(fā)育中隨時(shí)間變化而發(fā)生變化,在E13-E14畸形組PPPDE1蛋白表達(dá)水平要顯著高于同等水平正常組(E13,0.54±0.03(正常組)vs.0.67±0.08(畸形組);E14,0.48±0.003(正常組)vs.0.65±0.11(畸形組);p0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果,PPPDE1在正常組胎鼠和ARMs組胎鼠mRNA表達(dá)水平存在差異,從E13-E16,在胎鼠肛門直腸處表達(dá)逐漸增強(qiáng)。與正常組胎鼠相比較,ARMs組胎鼠在E13天表達(dá)明顯高于正常組(E13,1.00±0.04(正常組)vs.1.24±0.13(畸形組);p0.05)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1、ETU致畸的肛門直腸畸形胎鼠在肛門直腸發(fā)育過(guò)程中PPPDE1基因的表達(dá)存在著時(shí)間-空間的不均衡性特點(diǎn)。2、ETU致畸的大鼠胚胎期直腸發(fā)育過(guò)程中PPPDE1基因表達(dá)模式的改變可能會(huì)引起肛門直腸畸形的發(fā)生,影響泄殖腔細(xì)胞凋亡。3、PPPDE1表達(dá)上調(diào)可能與肛門直腸畸形的發(fā)生有關(guān)。
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果E13 天，正常組：尿直腸膈開始下降把泄殖腔分為尿生殖竇和原始直腸兩部分，泄殖腔形態(tài)管呈三角形。在尿直腸膈 URS 和后腸上皮中檢測(cè)到少量的PPPDE1 陽(yáng)性細(xì)胞(圖 3.1 A，B)。ARMs 組：尿直腸膈 URS 和泄殖腔膜之間的距離間隔比較遠(yuǎn)。在尿直腸膈 URS 和后腸上皮組織中可以觀察到大量的 PPPDE1陽(yáng)性細(xì)胞 (圖 3.1 C，，D)。

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文E14 天，正常組：尿直腸膈突出，其尖端接近泄殖腔膜，幾乎融合，可以看到尿直腸膈 URS 和泄殖腔膜 CM 有一條竇道。PPPDE1 陽(yáng)性細(xì)胞散在分散在尿直腸膈和泄殖腔膜上（圖 3.2 A，B）。ARMs 組：尿直腸膈 URS 在泄殖腔里的位置較高，尿直腸膈和泄殖腔膜之間的間距較長(zhǎng)，隨后發(fā)育過(guò)程中尿直腸膈沒有與泄殖腔膜進(jìn)行融合，而出現(xiàn)直腸尿道瘺。PPPDE1 細(xì)胞在尿直腸膈和泄殖腔膜表達(dá)較正常組明顯（圖 3.2 C，D）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R725.7

【參考文獻(xiàn)】

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