【摘要】：茭白孕茭是由菰黑粉菌侵染植株后誘導(dǎo)莖部器官形態(tài)發(fā)育變化的結(jié)果,膨大后植株莖部頂端生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)受到顯著抑制。PIN1是IAA極性運(yùn)輸?shù)妮敵鲚d體,在植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要調(diào)節(jié)作用,參與了植物胚胎發(fā)育、維管組織發(fā)育、細(xì)胞大小、向性運(yùn)動(dòng)、花器官發(fā)育等重要調(diào)控。本研究克隆獲得雙季茭白“浙茭7號(hào)”IAA極性運(yùn)輸相關(guān)基因Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因的全長(zhǎng)序列,明確其在茭白莖部膨大發(fā)育中的表達(dá)模式,闡明了IAA及TIBA對(duì)莖部PIN1相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)模式,結(jié)合莖部菰黑粉菌菌絲生長(zhǎng)分布動(dòng)態(tài),探討了Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因表達(dá)與茭白莖部發(fā)育及孕茭表型的關(guān)系;基于菰黑粉菌體外培養(yǎng)及田間孕茭生產(chǎn)的比較分析,明確了IAA及TIBA對(duì)菰黑粉菌菌絲體外融合生長(zhǎng)及茭白田間生產(chǎn)的調(diào)節(jié)作用,探討了基于IAA極性運(yùn)輸調(diào)節(jié)促進(jìn)茭白孕茭的可能機(jī)制。此外,構(gòu)建了茭白Zl-PIN1過(guò)表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化體系,為后續(xù)茭白基因功能驗(yàn)證分析提供了技術(shù)支撐。主要結(jié)果如下:一、茭白Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因全長(zhǎng)克隆克隆獲得茭白Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因全長(zhǎng)序列,均具有植物生長(zhǎng)素輸出載體蛋白PIN1特有的Mem_trans結(jié)構(gòu)域。Zl-PIN1基因組全長(zhǎng)為2408 bp,cDNA全長(zhǎng)為1 770 bp,編碼589個(gè)氨基酸,含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子,與粳稻關(guān)系較近,氨基酸序列相似性為96%;Zl-PIN1b基因組全長(zhǎng)為2024bp,cDNA全長(zhǎng)為1 563 bp,編碼526個(gè)氨基酸,含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,與野生稻關(guān)系較近,氨基酸序列相似性為87%;Zl-PIN1c基因組全長(zhǎng)為2421 bp,cDNA全長(zhǎng)為1 797 bp,編碼598個(gè)氨基酸,含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子,與野生稻關(guān)系較近,氨基酸序列相似性為95%。進(jìn)化樹分析表明:Zl-PIN1與Zl-PIN1c可聚為一類,與Zl-PIN1b距離較遠(yuǎn),可能與預(yù)測(cè)的蛋白跨膜螺旋區(qū)結(jié)構(gòu)不同相關(guān)。二、Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因在茭白莖部發(fā)育中的表達(dá)模式分析3種孕茭表型間的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因與茭白莖部器官的形態(tài)轉(zhuǎn)變相關(guān):膨大初期的正常茭白與灰茭莖部中3個(gè)基因表達(dá)量均顯著低于雄茭(P0.05);雄茭莖部發(fā)育前中期(5葉期與8葉期)3個(gè)基因的表達(dá)變化沒有顯著差異,但在莖部伸長(zhǎng)發(fā)育后(正常茭白膨大初期)表達(dá)顯著升高(P0.05),表明Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c可能參與了茭白莖部拔節(jié)發(fā)育相關(guān)的頂端生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。膨大莖部Zl-PIN1與Zl-PIN1c表達(dá)模式基本一致,并與Zl-PIN1b表達(dá)模式差異顯著:正常茭白莖部膨大發(fā)育期間Zl-PIN1與Zl-PIN1c表達(dá)量逐漸升高,并在莖部膨大發(fā)育到10 cm時(shí)表達(dá)量最高,隨后表達(dá)量顯著下降(P0.05);而Zl-PIN1b基因在莖部發(fā)育中表達(dá)量逐漸降低,膨大發(fā)育10 cm時(shí)顯著升高,隨后顯著下降(P0.05),可能與膨大莖部的伸長(zhǎng)相關(guān)。灰茭莖部3個(gè)基因表達(dá)模式與正常茭白存在差異:莖部發(fā)育期間Zl-PIN1與Zl-PIN1c表達(dá)量逐漸升高,膨大后期表達(dá)量顯著高于正常茭白(P0.05);而Zl-PIN1b基因逐漸降低,膨大10 cm時(shí)灰茭莖部基本不表達(dá),可能與正常茭白與灰茭莖部菰黑粉菌侵染及生長(zhǎng)分布狀態(tài)的顯著差異相關(guān)。茭白莖部Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因表達(dá)受IAA及TIBA誘導(dǎo)調(diào)節(jié),劑量效應(yīng)顯著:IAA處理可以顯著誘導(dǎo)雄茭莖部Zl-PIN1及Zl-PIN1b基因上調(diào)表達(dá)(P0.05),但對(duì)Zl-PIN1c基因的誘導(dǎo)表達(dá)不顯著;IAA處理后正常茭白莖部3個(gè)基因表達(dá)均顯著下調(diào)(P0.05);此外,高濃度TIBA處理后正常茭白莖部中3個(gè)基因表達(dá)均顯著下調(diào)(P0.05),但低劑量抑制效果不顯著。正常茭白莖部Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因的誘導(dǎo)表達(dá)可能與其莖部菰黑粉菌菌絲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)相關(guān)。莖部組織切片觀察發(fā)現(xiàn):正常茭白植株發(fā)育期間,莖部菰黑粉菌菌絲生長(zhǎng)及分布逐漸增強(qiáng);高濃度TIBA處理后,8葉期茭白莖部中大量增殖分布的菰黑粉菌菌絲生長(zhǎng)受到抑制。三、生長(zhǎng)激素對(duì)菰黑粉菌體外培養(yǎng)及菌絲生長(zhǎng)的影響菰黑粉菌菌株的體外融合菌絲生長(zhǎng)分析發(fā)現(xiàn):IAA能夠促進(jìn)菰黑粉菌菌絲生長(zhǎng),T型和MT型菌株間的促進(jìn)效果基本一致,與IAA處理濃度成正相關(guān);低濃度TIBA可以促進(jìn)菰黑粉菌菌絲生長(zhǎng),而高濃度TIBA能夠抑制菰黑粉菌菌絲生長(zhǎng),菰黑粉菌單倍體菌株培養(yǎng)干重量的顯著降低(P0.05)。T與MT型菌株間對(duì)TIBA處理的耐受能力存在差異:10μM的TIBA處理后,T型與MT型菌株干重均未受到顯著影響,但T型菌株菌絲生長(zhǎng)受到抑制,而MT型菌株菌絲生長(zhǎng)促進(jìn)效果較好,MT型菌絲生長(zhǎng)對(duì)TIBA的耐受力較強(qiáng);50μM的TIBA處理后,T型與MT型菰黑粉菌均無(wú)法形成融合菌絲,MT型菌株干重顯著減少(P0.05),而T型菌株干重變化不顯著,T型菌株單倍體生長(zhǎng)對(duì)TIBA的耐受力較強(qiáng)。此外,6-BA能促進(jìn)T型菰黑粉菌菌絲生長(zhǎng),并與濃度呈正相關(guān),與IAA處理結(jié)果類似;低濃度6-BA(1-5μM)處理能夠促進(jìn)MT型菰黑粉菌融合菌絲生長(zhǎng),而高濃度6-BA可以抑制融合菌絲的生長(zhǎng),與TIBA處理結(jié)果類似。四、生長(zhǎng)激素對(duì)茭白田間孕茭生產(chǎn)的調(diào)節(jié)分析生長(zhǎng)激素處理能夠有效調(diào)節(jié)茭白田間孕茭生產(chǎn)的采收周期及產(chǎn)量。孕茭起始時(shí)外源IAA噴施能夠延遲茭白采收,采收盛期延遲約9-12天,但對(duì)茭白產(chǎn)量影響不明顯;TIBA能夠促使茭白采收盛期提前,產(chǎn)量增加集中在采收前期;而6-BA處理可以增加茭白采收中期的產(chǎn)量。茭白經(jīng)濟(jì)學(xué)性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn):IAA處理能夠減少茭白有效分蘗數(shù),而TIBA和6-BA處理能夠顯著提高茭白的有效分蘗數(shù)(P0.05),田間增產(chǎn)效果明顯;外源激素處理對(duì)殼茭重、凈茭重及茭肉長(zhǎng)和粗等性狀影響不顯著。田間植物學(xué)性狀分析表明:IAA有助于促進(jìn)茭白株高、葉長(zhǎng)和葉寬的生長(zhǎng),而TIBA和6-BA對(duì)茭白株高增長(zhǎng)具有一定抑制作用,但與對(duì)照相比差異不顯著。結(jié)合生長(zhǎng)激素對(duì)菰黑粉菌體外培養(yǎng)的影響分析,TIBA可能通過(guò)影響莖部菰黑粉菌菌絲生長(zhǎng)及IAA極性運(yùn)輸,調(diào)節(jié)茭白莖部膨大起始后的生長(zhǎng)發(fā)育,促進(jìn)茭白植株?duì)I養(yǎng)物質(zhì)在植株頂端生長(zhǎng)及莖部膨大發(fā)育中的有效分配。五、Zl-PIN1過(guò)表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建構(gòu)建了Zl-PIN1的過(guò)表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化載體pFGC-Egfp-Zl-PIN1,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苗端生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化野茭植株,PCR篩選鑒定獲得10株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株,基于GFP熒光信號(hào)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),Zl-PIN1蛋白定位在維管束周圍細(xì)胞的細(xì)胞膜底部,與已報(bào)道的OsPIN1定位一致,初步確定獲得茭白Zl-PIN1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株,轉(zhuǎn)化率約為3.7%。
【圖文】：

Zl-PIN1b 及 Zl-PIN1c 基因全長(zhǎng)序列克隆1 基因全長(zhǎng)序列克隆因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析[19]，以茭白 cDNA 和基引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖 2.1 所示，白 Zl-PIN1 基因的 DNA 全長(zhǎng)序列為 2 408 bp；碼 589 個(gè)氨基酸。采用 Clone Manager 軟件т析發(fā)現(xiàn)：茭白 Zl-PIN1 基因含有 6 個(gè)外顯子和子大小分別為 1 117 bp、271 bp、88 bp、156 bp為 87 bp（第 1118 個(gè)堿基到第 1204 個(gè)堿基）、5 個(gè)堿基）、89 bp（第 1674 個(gè)堿基到 1762 個(gè)基到 2158 個(gè)堿基）、103 bp（第 2239 個(gè)堿基到

中國(guó)計(jì)量大學(xué)碩士學(xué)位論文圖 2.2 Zl-PIN1 基因組和 cDNA 比對(duì)圖2.2.1.2 Zl-PIN1b 基因全長(zhǎng)序列克隆以茭白 cDNA 和 DNA 為模板，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖 2.3 所示，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)：茭白 Zl-PIN1b 基因的 DNA 序列全長(zhǎng)為 2 024 bp；cDNA 序列全長(zhǎng)為 1 563 bp，，編碼 526 個(gè)氨基酸。采用 CloneManager 軟件т的 Align multiple sequences 比較分析發(fā)現(xiàn)：茭白 Zl-PIN1b 基因包含 4 個(gè)外顯子和 3 個(gè)內(nèi)含子（圖 2.4），4 個(gè)外顯子大小分別為 1 036 bp、248bp、86 bp、211 bp，3 個(gè)內(nèi)含子分別為 259 bp（第 1037 個(gè)堿基到第 1295 個(gè)堿基）、104 bp（第 1544 個(gè)堿基到第 1647 個(gè)堿基）、80 bp（第 1734 個(gè)堿基到1813 個(gè)堿基）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)計(jì)量大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S645.2

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本文編號(hào)：2687785