【摘要】：纖維素作為一種含糖量最為豐富的可再生能源,在解決能源短缺方面具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)纖維素酶降解纖維素是一種既環(huán)保又高效的方法。在纖維素降解過程中,酶活力高、熱穩(wěn)定性強的纖維素酶是提高酶解效率、減少成本的關(guān)鍵。嗜熱真菌產(chǎn)生的纖維素酶具有較高的酶活性及熱穩(wěn)定性。本研究分別將嗜熱毀絲菌糖苷水解酶第七家族外切葡聚糖酶cbh1基因和嗜熱毛殼菌糖苷水解酶第七家族內(nèi)切葡聚糖酶eg2基因進行克隆、表達,獲得外切葡聚糖酶CBH1和內(nèi)切葡聚糖酶EG2。將純化的蛋白CBH1和EG2進行SDS-PAGE電泳檢測,CBH1的理論大小為54 kDa,而電泳結(jié)果顯示蛋白的大小為72 kDa,推測蛋白可能存在糖基化修飾;EG2的電泳結(jié)果顯示蛋白的大小為45 kDa,與理論值大小(45 kDa)相符。為了獲得具有更高活性的纖維素酶,提高纖維素酶對纖維素的降解效率,本研究分別對CBH1和EG2進行分子改造,期望可以獲得具有更高酶活性及熱穩(wěn)定性的纖維素酶。根據(jù)同源建模的方法,分別對外切葡聚糖酶CBH1和內(nèi)切葡聚糖酶EG2進行三維結(jié)構(gòu)的預測。糖苷水解酶第七家族(GH7)外切葡聚糖酶(CBHs)在催化中心活性通道的頂端有一個環(huán)狀結(jié)構(gòu),嗜熱毀絲菌糖苷水解酶第七家族外切葡聚糖酶CBH1的環(huán)狀結(jié)構(gòu)由9個氨基酸組成,即G245-Y253,將該結(jié)構(gòu)進行敲除,獲得缺失突變體CBH1-DM;根據(jù)三維結(jié)構(gòu),選取CBH1底物結(jié)合平面內(nèi)四個保守的芳香族氨基酸W38、W40、W372和W381以及EG2活性通道內(nèi),位于活性位點6?范圍內(nèi)的五個非保守氨基酸A141、L145、M195、I207和M342進行定點突變,獲得CBH1的八個突變酶W38Y、W38F、W40Y、W40F、W372Y、W372F、W381Y和W381F以及EG2的四個突變酶A141S、L145T、M195L、I207V和M342F。將原酶和突變酶進行酶學性質(zhì)的測定。實驗結(jié)果表明,本研究已經(jīng)成功獲得兩個酶活力提高的突變體,分別為CBH1-DM和W38Y。CBH1-DM的比活力為2.42 U/mg,是野生酶CBH1(1.17 U/mg)的2.1倍,突變酶W38Y的比活力為1.3 U/mg,是CBH1(1.17U/mg)的1.1倍,剩余突變酶的酶活均有不同程度的降低;CBH1、CBH1-DM的最適溫度均為50℃,剩余突變酶的最適溫度為60℃;CBH1及突變酶的最適pH均為5.0;在70℃處理1小時后,CBH1僅剩余35%的酶活力,而CBH1-DM剩余65%的酶活力,CBH1-DM的熱穩(wěn)定性顯著提高,而其他突變酶的熱穩(wěn)定性均有不同程度的降低。突變酶與野生酶EG2相比,酶活性均有不同程度的降低;EG2與突變酶最適溫度均為50℃,最適pH均為5.0;與EG2相比,在80℃處理1小時后,EG2具有50%的酶活,而M195L具有65%的酶活,M195L的熱穩(wěn)定性提高,而其他突變酶的熱穩(wěn)定性均有不同程度的降低。
【圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文和一個球形的頭部，如圖 1-1 所示（Esterbauer et al., 1991）。經(jīng)過不斷研酶的分子結(jié)構(gòu)均類似于蝌蚪狀，整個纖維素酶分子由三部分組成，分別是cellulose-binding domains CBD）、催化結(jié)構(gòu)域（catalytic domains CD）和er）（Srisodsuk et al., 1993; 閻伯旭和高培基, 1995）。

圖 1-3 協(xié)同作用假說模式圖Fig.1-3 Model of Synergetic hypothesis酶的應用產(chǎn)生的纖維素酶具有較高的活性及產(chǎn)量，因此在環(huán)境治理和食用：在榨取蔬菜汁、水果汁的過程中加入纖維素酶可以提高汁液的汁液，而且獲得的汁液不易產(chǎn)生沉淀（Beguin andAubert, 19纖維素酶可以加強對原料的利用效率，提升酒的品質(zhì)（高蕾蕾等；利用纖維素酶可以制備一些酶制劑，各種酶制劑的生產(chǎn)對危機具有重要的作用（Zhang et al., 2006; Angenent et al., 2004油開采過程中使用破乳劑可以減少對地面的破壞（王玉芝, 19展以及人們生活質(zhì)量的提高，，對生活垃圾的處理越來越受到人要成分有纖維素和木質(zhì)素，瘤胃真菌產(chǎn)生的纖維素酶能將纖維理生活垃圾方面起到很好的作用（Mountfort et al., 1982）。此
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q936;Q78

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1 羅會穎;姚斌;范云六;;嗜酸糖苷水解酶研究進展[J];中國農(nóng)業(yè)科技導報;2013年05期

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本文編號：2687588